#13 Очистка нуклеиновых кислот: многообразие методов и подходов

До сегодняшнего дня мы предлагали лишь решения по колоночному выделению: наборы для выделения геномной ДНК, ДНК из образцов крови, плазмидной ДНК, ДНК из агарозного геля и из ПЦР продуктов. На сегодняшний день, множество решений для очистки и выделения ДНК представлены на рынке, какой из методов выбрать - это решение, которое принимает каждый индивидуальный исследователь. Методы отличаются друг от друга сферой применения, подходом, задачей, и конечно же ценой. Иногда, исследователям удобнее использовать метод, который для них более привычен, однако следует принять во внимание, что каждый день появляются все более прогрессивные новинки, которые могут существенно помочь и ускорить все процессы в лаборатории. 

Сегодня мы постараемся систематизировать и объяснить наиболее распространенные методы выделения и очистки РНК и ДНК, и рассказать в целом для чего он могут применяться, и, конечно же, предложить отдельные конкретные продукты, которые вы сможете начать использовать уже в ближайшие недели! 

Колоночное выделение

Метод колоночного выделения использует способность ДНК и РНК адгезироваться к поверхности материала silica в присутствии хаотропных ионов, и легко смываться в их отсутствии. Данный метод пришел из органической химии, где на первых этапах набивались стеклянные колонки различными материалами, в том числе silica, потом ДНК и РНК смывались, и далее колонка разбиралась и набивалась заново. Чтобы исключить эти трудоемкие этапы, было предложено использовать одноразовые пластиковые колонки, уже с прослойкой silica-мембраны, которые идеально подходят по размеру к обычным пробиркам эппендорф на 1,5 и 2 мл.

Таким образом, приобретая набор для колоночного выделения - вы получаете определенное количество готовых колонок, в них вы добавляете ваш образец, откуда будет происходить выделение ДНК/РНК, в специальном буфере, в условиях которого будет происходить связывание ДНК/РНК c поверхностью мембраны, вставляете пробирку, куда будет собираться свободная от ДНК/РНК жидкость, и центрифугируете. Далее, мембрана промывается - чтобы удалить все ненужные примеси и вещества. После этого, добавляется буфер для смывки нуклеиновых кислот, которые смываются во время центрифугирования в специально подготовленную пробирку. Казалось бы, процесс достаточно прост, почему же существует такое разнообразие наборов для выделения? В том числе и наборы для колоночного выделения ISOLATE II. Основные различия происходят на этапе подготовки образца, содержащего нуклеиновые кислоты. Иногда проведения лизиса не требуется (в случае наборов для выделения ДНК из ПЦР продуктов), но требуется экстракция (как в случае выделения из агарозного геля). Иногда требуется лизис бактерий (набор для выделения плазмидной ДНК), лизис тканей (набор для выделения геномной ДНК). В случае выделения ДНК из крови, существует как протокол выделения ДНК из клеток крови, так и из сыворотки (например, если требуется идентифицировать ДНК вирусов), все это обеспечивает набор для выделения ДНК из крови. Выделение ДНК из крови может быть осложнено добавками к образцам крови различных реактивов для консервации крови, для чего компания Bioline разработала специальные решения.

Энзиматическая очистка ПЦР-продуктов

Несмотря на то, что колоночное выделение - хорошее решение для получения чистых ДНК и РНК, но иногда нужно более дешевое и быстрое решение для специальных нужд. Поэтому, компанией New England Biolabs было предложено новое решение для очистки ПЦР реакции при помощи смеси энзимов. Смесь щелочной фосфатазы и эндонуклеаззы VIII удаляет все dNTPи непрореагировавшие праймеры, и если ДНК/РНК, поступившая в ПЦР реакцию не была загрязнена другими примесями, через 15 минут вы получаете готовый образец для дальнейшего использования для секвенирования по Сэнгеру или NGS или для любого другого назначения, без проведения каких-либо других этапов. Быстрый протокол (время проведения очистки в два раза меньше других аналого на рынке) низкая стоимость одного выделения, подкрепленные традиционным качеством всех продуктов от New England Biolabs позволят этому набору завоевать сердца множества исследователей.

Очистка ДНК при помощи магнитных частиц

Одним из самых прогрессивных и наиболее совершенных методов очистки ДНК, существующих на сегодняшний день, является очистка ДНК при помощи магнитных частиц. Все чрезвычайно просто - в образец добавляется взвесь магнитных частиц, ДНК адгезируется к ним, потому пробирка ставится в магнитный штатив, магнитные частицы собираются на стенке пробирки, супернатант собирается и удаляется. Потом для промывки частицы ресуспензируются, опять собираются на стенке. На последнем этапе ДНК смывается с магнитных частиц, частицы собираются на стенке, а чистый раствор ДНК отбирается для дальнейших исследований. Мы предлагаем набор Ampliclean для очистки ПЦР-продуктов и набор для очистки реакционной смеси D-Pure Dye Terminator (специально для использования перед секвенированием по Сэнгеру). Плюсы очевидны: ультра чистота продукта, быстрота, простота. Из минусов мы должны отметить более высокую цену в пересчете на реакцию, а также отсутствие других реагентов, если выделение происходит непосредственно из ткани, образца крови или бактериальной культуры.

Так как для проведения очистки на магнитных частица вам понадобятся специальные штативы, содержащие встроенные магниты, например штативы для микропробирок объемом 1.5 мл для магнитного разделения и штатив для 96-луночного планшета для магнитного разделения от New England Biolabs.

Специальные предложения от New England Biolabs для очистки РНК, обогащения мРНК и избавления от рибосомальной РНК

Специально для всех, кто выделяет РНК перед проведением реакции обратной транскрипции, чтобы далее проводить секвенирование или оценку при помощи реал-тайм или классической ПЦР - New England Biolabs предлагает набор для выделения РНК при помощи магнитных частиц, из клеточных культур и тканей, без использования органических реагентов и фенола - набор для магнитной экстракции мРНК а также набор PolyA Spin для экстракции мРНК из образцов общей РНК при помощи аффинной хроматографии.

В то же время - специально чтобы увеличить эффективность секвенирования образцов РНК, мы рады представить набор NEBNext для избавления от рибосомальной РНК от New England Biolabs.

Выделение ДНК и двуцепоченой РНК при помощи соосаждения

Другой вариацией использования силика-материалов для очистки нуклеиновых кислот является SureClean Plus для очистки нуклеиновых кислот, представленный компанией Bioline. Чрезвычайно простой и быстрый протокол позволит вам сэкономить время и деньги, а возможность дополнительно использовать розовый краситель упростит визуализацию осадка.

Фракционное разделение РНК, ДНК и протеинов при помощи экстракции

Если начальным образцом вам служит ткань, клетки или культура, из которой требуется отдельно получить ДНК, РНК протеины - то классической реактив TRIsure для фракционного разделения нуклеиновых кислот и протеинов от Bioline - ваш выбор!

Выделение ДНК при помощи лизиса при нагревании в присутствии полимерных материалов

Мы не можем обойти вниманием очень интересной решение от Nimagen: реактив GenePurgeDirect для выделения ДНК и РНК, для проведения протокола выделения ДНК и РНК из крови, бактериальных культур, тканей в парафине, образцов биопсии, хвостов мышей, растений и инфекционных агентов (например MTB, HIV) вам потребуется амплификатор или микроволновая печь (!!!).

GenePurgeDirect® состоит из полимерных материалов, которые обеспечивают быстрое извлечение нуклеиновых кислот из клеток в форме, которую можно использовать для ПЦР. Ингибиторы ПЦР, высвобождающие во время лизиса и другие вещества, которые могут принять участие в реакции ПЦР, сегрегируются с полимерным материалом, и супернатант, содержащий нуклеинвые кислоты, может быть использован напрямую для ПЦР. Протокол выделения занимает до 10 минут!

Заключение

Чтобы не запутаться среди большого разнообразия продуктов на рынке, хочется посоветовать две важных вещи, которые следует принять во внимание: имейте в виду, что стоимость следует оценивать исходя из цены в пересчете на одну вашу реакцию (с вашим объемом реагента), и что чем больше содержится количества реакций/объема в упаковке, тем дешевле выйдет одна очистка. Мы надеемся, что информация в нашем обзоре поможет удачно выбрать реактив для очистки, оптимизировать исследования и в конечном итоге удачно напечататься!