Реактивы, оборудование и
расходные материалы
для лабораторий
English version
пн-пт: 9:30-18:00 по МСК
0

#59 Новый набор Monarch® для выделения геномной ДНК от New England Biolabs

10.10.2019

Линейка реагентов Monarch® для выделения и очистки нуклеиновых кислот с использованием спин-колонок появилась в портфолио New England Biolabs почти 4 года назад. Но только сейчас компания порадовала нас набором для выделения геномной ДНК (гДНК). Такое томительное ожидание сполна окупилось превосходными характеристиками нового продукта, которым и посвящен наш обзор.

Мы уверены, что данный набор может стать любимым решением для выделения геномной ДНК в любой молекулярно-биологической лаборатории. Но особенно мы рекомендуем присмотреться к новинке тем, кто занимается нанопоровым секвенированием на приборах Oxford Nanopore Technologies.

Главные преимущества набора

  • Выделение гДНК из широкого спектра биологических образцов: тканей, клеток, крови, грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжей, слюны и буккального эпителия;
  • Возможность очистки гДНК, выделенной фенольно-хлороформным методом, и ДНК-продуктов ферментативных реакций;
  • Выход гДНК - до 70 мкг;
  • Высокое качество выделенной гДНК: A260/A280 > 1,8 и A260/A230 > 2,0, длина 50-70 т.н.п., DIN ~9;
  • Низкое содержание РНК в элюате (<1%);
  • Объем элюции - от 35 мкл;
  • В набор входят все необходимые реагенты, включая РНКазу A, но в то же время их можно купить отдельно;
  • Выделенная гДНК подходит для использования в таких приложениях, как ПЦР, включая амплификацию длинных фрагментов, ПЦР в реальном времени, секвенирование следующего поколения (NGS), в том числе на платформах, позволяющих получать длинные прочтения (Oxford Nanopore Technologies, Pacific Biosciences®);
  • Выделение занимает мало времени;
  • Конечный элюат не содержит частиц силики;
  • Отличное соотношение цена/качество.

Один набор для разных образцов

Согласитесь, это очень удобно, когда с помощью одного инструмента можно решить большой круг задач. Имея в распоряжении новый набор Monarch®, вам не придется для каждого типа образца подбирать индивидуальный метод выделения гДНК и приобретать дополнительные реагенты.

Валидированные типы образцов, которые можно использовать в качестве исходного материала при работе с набором Monarch® для выделения гДНК.
Тип образца Рекомендуемое количество Стандартный выход гДНК(мкг)
Показатель целостности ДНК (DIN) Максимальное количество
ТКАНЬ
Хвост (мыши) 10 мг 12-20 8,5-9,5 25 мг
Ухо (мыши) 10 мг 18-21 8,5-9,5 10 мг
Печень (мыши и крысы) 10 мг 15-30 8,5-9,5 15 мг
Почки (мыши) 10 мг 10-25 8,5-9,5 10 мг
Селезенка (мыши) 10 мг 30-70 8,5-9,5 10 мг
Сердце (мыши) 10 мг 9-10 8,5-9,5 25 мг
Легкие (мыши) 10 мг 14-20 8,5-9,5 15 мг
Головной мозг (мыши и крысы) 10 мг 4-10 8,5-9,5 12 мг
Мышцы (мышь и крыса) 10 мг 4-7 8,5-9,5
25 мг
Мышцы (олень) 10 мг 5 8,5-9,5 25 мг
КРОВЬ
Человек (цельная) 100 мкл 2,5-4 8,5-9,5 100 мкл
Мышь 100 мкл 1-3 8,5-9,5 100 мкл
Кролик 100 мкл 3-4 8,5-9,5 100 мкл
Свинья 100 мкл 3,5-5 8,5-9,5 100 мкл
Морская свинка 100 мкл 3-8 8,5-9,5 100 мкл
Корова 100 мкл 2-3 8,5-9,5 100 мкл
Лошадь 100 мкл 4-7 8,5-9,5 100 мкл
Собака 100 мкл 2-4 8,5-9,5
100 мкл
Курица (ядросодержащие эритроциты) 10 мкл 30-45 8,5-9,5 10 мкл
КЛЕТКИ
HeLa 1 x 106 клеток 7-9 9,0-9,5 5 x 106 клеток
HEK293 1 x 106 клеток 7-9 9,0-9,5 5 x 106 клеток
NIH3T3 1 x 106 клеток 6-7,5 9,0-9,5 5 x 106 клеток
БАКТЕРИИ
E. coli
2 x 109 клеток 6-10 8,5-9,0 2 x 109 клеток
Rhodobacter sp. 2 x 109 клеток 6-10 8,5-9,0 2 x 109 клеток
B. cereus 2 x 109 клеток 6-9 8,5-9,0 2 x 109 клеток
АРХЕИ
T. kodakarensis 2 x 109 клеток 3-5 8,5-9,0 2 x 109 клеток
ДРОЖЖИ
S. cerevisiae 2 x 109 клеток 3-5 8,5-9,0 2 x 109 клеток
ДРУГОЕ
Слюна человека 200 мкл 2-3 7,0-8,0 500 мкл
Буккальный эпителий человека 1 мазок 5-7 6,0-7,0 1 мазок

Высокий выход продукта можно ожидать даже для образцов тканей мозга, мышц и печени, которые обычно вызывают сложности при работе с наборами других производителей.

T3010_Monarch_gDNA_Figure4.png
Рис. 1. По 10 мг тканей головного мозга, мышц и печени крысы, стабилизированных реагентом RNAlater®, разрезали на маленькие кусочки и лизировали. Геномную ДНК выделяли согласно протоколам, рекомендованным компаниями-производителями наборов, включая этап обработки РНКазой А. Объем элюата - 100 мкл. Значения выхода ДНК, представленные на гистограмме, представляют собой средние значения для двух повторностей. Для точного определения количества ДНК в образце измеряли содержание в нем РНК методом LC-MS и делали соответствующую поправку.

Отличное качество выделенной гДНК

Размер и целостность геномной ДНК, выделяемой с помощью спин-колонок, зависит, прежде всего, от качества исходного материала. При соблюдении рекомендаций, приведенных в руководстве пользователя набором Monarch®, можно ожидать, что пиковая длина (peak size) выделенных фрагментов гДНК будет превышать 50 т.п.н., а показатель DIN лежать в диапазоне 8,5-9,5.

Исключения составляют образцы слюны и буккального эпителия, которые изначально содержат большое количество мертвых клеток с деградированной ДНК.

Monarch_gDNA_HiMolecWeight.png
Рис. 2. Электрофореграмма разделения в 0,75% агарозном геле образцов гДНК (100 нг), выделенных с помощью нового набора Monarch® из разных источников: 1 x 106 клеток HeLa, 100 мкл крови человека, 10 мкл крови птицы, по 10 мг хвоста, печени, головного мозга, мышцы мыши, 1 буккальный мазок, 500 мкл слюны, по 1 x 109 клеток E.coli и B.cereus. M - фрагменты рестрикции ДНК фага лямбда рестриктазой HindIII (NEB, арт. N3012). Пиковую длину фрагментов гДНК и показатель DIN определяли с помощью системы автоматизированного электрофореза 4200 TapeStation®(Agilent Technologies).

Еще одной распространенной проблемой при выделении гДНК является высокое содержание РНК в конечном препарате. При работе с наборами других производителей этот показатель может достигать 30-90%. Наличие РНК в растворе ДНК может приводить к неправильной количественной оценке последней.

Связывающий буфер набора Monarch® на основе хаотропной соли характеризуется низким содержанием спирта. Это обеспечивает специфическое связывание с мембраной гДНК при минимальном связывании РНК. При дополнительной обработке лизата РНКазой А содержание РНК в элюате не будет превышать 1%.

Использование гДНК, выделенной с помощью набора Monarch®

Геномную ДНК, выделенную с помощью набора Monarch®, можно использовать в различных приложениях, в том числе:

 ПЦР, ПЦР-амплификация длинных фрагментов, ПЦР в реальном времени

T3010_Monarch_gDNA_Figure2.jpg
Рис. 3. A Электрофореграмма разделения в 1,5% агарозном геле ампликонов длиной 6, 8, 10, 12, 16 и 20 т.п.н. Матрица – референсная ДНК NA19240 и гДНК человека, выделенная из клеток HeLa и крови с помощью нового набора Monarch®. Амплификацию проводили с помощью готовой смеси для ПЦР с LongAmp® Taq Hot Start ДНК-полимеразой (NEB, арт. M0533) на амплификаторе Applied Boisystems® 2720. Для оценки размера фрагментов использовали маркер 1 т.п.н. длин ДНК (NEB, арт. N3232). B Кривые накопления продуктов ПЦР в реальном времени. Матрица – гДНК из крови человека, клеток HeLa и мышиных хвостов, выделенная с помощью набора Monarch®. Амплификацию проводили c помощью универсальной готовой смеси Luna® (NEB, арт. M3003) на реал-тайм амплификаторе Bio-Rad® CFX Touch.

Пробоподготовка для NGS

T3010_Monarch_gDNA_Figure3.png
Рис. 4. A Профиль покрытия при секвенировании на платформе Illumina MiSeq библиотек, подготовленных с помощью набора NEBNext® Ultra™ II FS с фрагментазой (NEB, арт. E7805). Исходный материл – гДНК из клеток HeLa, выделенная с помощью набора Monarch® (оранжевый, 2 повторности) и с помощью набора DNeasy® Mini Kit (Qiagen, синий, 2 повторности). Выравнивание на референсную последовательность и оценка покрытия GC-богатых участков производилась с использованием программ Bowtie 2.2.4 и Picard’s CollectGCBiasMetrics (v1.117). Серая горизонтальная линия - ожидаемое нормализованное покрытие 1.0, разноцветные кривые - нормализованное покрытие для каждой из библиотек, серая гистограмма - распределение количества коротких прочтений в зависимости от содержания GC. B Выход библиотек оценивали с помощью системы автоматизированного электрофореза 2100 Bioanalyzer и набора реагентов для высокочувствительного анализа ДНК (Agilent Technologies).

Нанопоровое секвенирование

Monarch_gDNA_HumanHeLaNanopore_1218.png
Рис. 5. Геномную ДНК выделяли из клеток HeLa с помощью наборов Monarch® (оранжевый) и Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit (синий). По 1 мкг очищенной гДНК использовали для приготовления библиотек к нанопоровому секвенированию по протоколу Ligation Sequencing kit 1D (Oxford Nanopore Technology, арт. SQK-LSK109) без фрагментации. Библиотеки секвенировали на нанопоровом секвенаторе GridION с проточными ячейками R9.4.1. Данные собирали в течение 48 часов. A. Общее количество собранных данных, B. Качество прочтений, C. Длина прочтений.

Поддерживаемые протоколы

  • Выделение геномной ДНК из клеточных культур;
  • Выделение геномной ДНК из крови (в том числе, содержащей ядросодержащие эритроциты);
  • Выделение геномной ДНК из тканей;
  • Выделение геномной ДНК из грамотрицательных бактерий и архей;
  • Выделение геномной ДНК из грамположительных бактерий;
  • Выделение геномной ДНК из дрожжей;
  • Выделение геномной ДНК из слюны;
  • Выделение геномной ДНК из буккального эпителия;
  • Очистка геномной ДНК, выделенной иными способами.

Особенности протоколов выделения

Протокол выделения гДНК с помощью нового набора Monarch® состоит из стандартных этапов (лизирование, связывание с мембраной спин-колонок, промывка и элюция), но имеет некоторые особенности.

Протокол Monarch_gDNA.png
Рис. 6. Схема протокола выделения геномной ДНК с помощью нового набора Monarch®

Лизирование

Поскольку один лизирующий буфер не может одинаково эффективно лизировать биологические образцы разного типа, в состав набора для этих целей включены три буфера: для крови, тканей и клеток.

Буфер для лизирования тканей позволяет работать с образцами, истертыми в азоте, а также замороженными или стабилизированными реагентом RNAlater® кусочками тканей. При наличии в лизате нерасщепленного материала его необходимо центрифугировать перед нанесением на мембрану.

Связывание с мембраной спин-колонок и промывка

Связывание гДНК с мембраной осуществляется во время центрифугирования на низких скоростях, что увеличивает эффективность этого процесса. Сразу после этого проводят высокоскоростное центрифугирование, которое очищает мембрану от таких компонентов лизата, как белки, соли, углеводы.

Промывка мембраны состоит из двух этапов. При этом сразу после нанесения промывочного буфера колонку закрывают и переворачивают несколько раз, чтобы смыть возможные остатки предыдущих растворов со стенок и крышки.

Элюция

Основная особенность этапа элюции заключается в том, что для этих целей используют буфер, предварительно нагретый до 60°С. Это существенно увеличивает эффективность процесса, что особенно важно для длинных фрагментов ДНК, которые связаны с мембраной сильнее, чем короткие.

Рекомендуемый объем элюции – 100 мкл, но при необходимости он может быть снижен до 35 мкл с потерей выхода продукта до 20%.

Информация для заказа

Набор Monarch® для выделения геномной ДНК содержит все компоненты, необходимые для реализации поддерживаемых протоколов. В то же время, каждый компонент можно приобрести отдельно.

Артикул Наименование Количество
T3010 L/S Набор Monarch® для выделения геномной ДНК 150/50 выделений
T3017 L Колонки Monarch® для выделения геномной ДНК 100 шт. + 200 пробирок для сбора фильтрата
T2018 L Пробирки Monarch® для сбора фильтрата II 100 шт.
T3011 L Буфер Monarch® для лизирования тканей при выделении геномной ДНК 34 мл
T3012 L Буфер Monarch® для лизирования клеток при выделении геномной ДНК 20 мл
T3013 L Буфер Monarch® для лизирования крови при выделении геномной ДНК 20 мл
T3014 L Буфер Monarch® для связывания при выделении геномной ДНК 65 мл
T3015 L Буфер Monarch® для промывки при выделении геномной ДНК 60 мл
T3016 L Буфер Monarch® для элюции при выделении геномной ДНК 34 мл
T3018 L Monarch® РНКаза A (20 мг/мл) 1 мл
P8107 S Протеиназа К высокой степени очистки (800 е.а./мл) 2 мл

Если вы хотите получить пробник нового набора Monarch® для выделения геномной ДНК, позвоните по телефону 8 (495) 215-02-22 или 8 (800) 333‑22‑26, напишите по электронной почте info@skygen.сom или свяжитесь с менеджером по вашему региону.

Обратная связь

© 2012-2019 SkyGen
Информация и цены на сайте не являются публичной офертой
На нашем веб-сайте мы используем файлы cookie, которые помогают нам создать максимально удобные для посетителя условия пользования сайтом. Если Вы продолжите использовать сайт, мы будем считать что Вас это устраивает.
ОK