Oxford Nanopore Technologies

логотип Oxford Nanopore Technologies Oxford Nanopore Technologies - британская компания, поставляющая секвенаторы, наборы и расходные материалы для нанопорового секвенирования нуклеиновых кислот.

Компания SkyGen является эксклюзивным дистрибьютором продукции ONT в России и СНГ.

ДНК Секвенаторы: история развития технологий

Сегодня определение последовательности ДНК или РНК — рутинная процедура, используемая практически каждой лабораторией. Однако первые технологии секвенирования были очень затратными в плане времени, финансов и человеческих ресурсов, при этом они использовались лишь для прочтения коротких фрагментов геномов. Одна из передовых современных технологий — нанопоровое секвенирование — качественно изменила подход к расшифровке последовательностей. Теперь можно дешево и быстро секвенировать последовательности почти любой длины даже вдали от лабораторий.

Метод Сэнгера

Технологии секвенирования ДНК появились в 1970-х годах. Первое поколение автоматических секвенаторов появилось благодаря методу, предложенному английским биохимиком Фредериком Сэнгером. Метод Сэнгера работает так:

Используются ДНК-полимераза, праймер для начала синтеза новых цепочек ДНК, обычные нуклеотиды и нуклеотиды, с химической структурой, не позволяющей достраивать цепь после их вставки (дидезоксинуклеотиды, или терминирующие нуклеотиды), которые содержат радиоактивную или флуоресцентную метку для детекции продукта. В других вариантах методики метку могут нести обычные нуклеотиды или праймер.
В четырех разных пробирках анализируемая матрица участвует в реакции синтеза ДНК. В каждой пробирке содержится один из четырех терминирующих нуклеотидов.
При включении терминирующих нуклеотидов в ДНК синтез обрывается.
В каждой пробирке получается смесь фрагментов разной длины: в одной все фрагменты с окончанием на А, в другой — на Т, и т.д.
Смесь разделяют методом электрофореза и таким образом определяют порядок нуклеотидов в анализируемой ДНК.

Секвенирование по Сэнгеру остается «золотым стандартом», оно дает самые точные результаты. Однако с помощью этого метода можно прочитать последовательность длиной лишь до 1 кб нуклеотидов, поэтому он применяется для небольших фрагментов ДНК.

Секвенирование по Сэнгеру используют для:

● Анализа мутаций и полиморфизмов

● Таксономического определения

● Анализа микросателлитов

● Валидации результатов других методов секвенирования

Сейчас разделение фрагментов ДНК происходит в специальных капиллярных секвенаторах при помощи капиллярного электрофореза.

Пиросеквенирование

В этой технологии для детекции вставки определенного нуклеотида используется превращение побочного продукта (пирофосфата) в АТФ. Эта молекула далее участвует в реакции с выделением света, катализируемой люциферазой.

И метод Сэнгера, и пиросеквенирование — это секвенирование путем синтеза (sequencing by synthesis).

Благодаря компании 454 Life Sciences, запатентовавшей и использовавшей технологию пиросеквенирования, произошли значительные перемены в устройстве секвенаторов.

Секвенаторы ДНК 454 Life Sciences — это секвенаторы нового поколения, которые позволили параллельно проводить множество реакций секвенирования благодаря использованию индивидуальных адаптеров для фрагментов ДНК.

ДНК фрагментируется.
К фрагментам присоединяются ДНК-адаптеры.
С помощью адаптеров фрагменты прикрепляются к магнитным сферам.
Получают эмульсию, в которой для каждого фрагмента ДНК индивидуально проходит реакция амплификации (в каждой капле находится по одной бусине).
Проводят массовую реакцию пиросеквенирования на чипе.

Метод, предложенный 454 Life Sciences, положил начало технологиям секвенирования нового поколения, Next Generation Sequencing (NGS). Основной принцип, лежащий в основе NGS-секвенаторов, — это распараллеливание, которое дает возможность проводить большое количество реакций секвенирования за один прогон.

Ионное полупроводниковое секвенирование

При использовании этой NGS-технологии (компания Ion Torrent), нуклеотидная последовательность напрямую преобразуется в цифровую информацию:

Во время синтеза ДНК при включении комплементарного нуклеотида высвобождается ион водорода
Происходит изменение рН раствора
Датчик регистрирует скачок напряжения

Секвенирование на молекулярных кластерах

Сейчас широко используется технология Illumina, впервые разработанная компаниями Solexa и Lynx Therapeutics — секвенирование на молекулярных кластерах.

К фрагментам ДНК пришиваются адаптеры.
С помощью адаптеров ДНК прикрепляется к олигонуклеотидам на подложке.
Запускается «мостиковая амплификация», которая позволяет получить множество копий фрагмента, формирующих кластеры.
Во время амплификации ДНК используются модифицированные терминирующие нуклеотиды с флуоресцентными метками.
После вставки нуклеотида свечение флуорофора регистрируется.
Нуклеотид модифицируется так, чтобы синтез ДНК можно было продолжать.
Цикл повторяется.

Одномолекулярное секвенирование в реальном времени (SMRT, single molecule real time sequencing)

Этот метод, предложенный компанией Pacific Biosciences (PacBio), позволяет секвенировать длинные фрагменты — 30-50 кб и более. Визуализация включения нуклеотида с флуорофором в растущую цепь происходит при помощи направленного точечного пучка света, освещающего дно лунки, где находится ДНК-полимераза, связанная с ДНК.

Соответственно, идентификация нуклеотидов происходит со скоростью их включения. Это позволяет использовать технологию еще и для обнаружения модификаций оснований, так как многие из модифицированных оснований добавляются в цепь ДНК с разной скоростью.

Oxford Nanopore Sequencing

Наконец, качественно иной подход к одномолекулярному секвенированию предложила компания Oxford Nanopore Technologies. Технология нанопорового секвенирования (nanopore sequencing) основана на измерении скорости потока ионов при прохождении нуклеиновых кислот через нанопору. Каждый нуклеотид по-разному меняет проводимость, и это можно зафиксировать при помощи детектора.

Для секвенирования можно использовать биологические нанопоры и твердотельные нанопоры. В основе биологических нанопор —- трансмембранные белки. Скорость прохождения ДНК через поры регулируется добавлением высокопроизводительной ДНК-полимеразы. Используются и другие вспомогательные белки, которые помогают раскручивать ДНК и пропускать ее через пору.

Компания Oxford Nanopore Technologies использует белковые нанопоры, закрепленные в полимерной мембране, через которые пропускается ток. Хотя количество ошибок при секвенировании сравнительно велико, именно нанопоры позволяют секвенировать за одно прочтение рекордно длинные фрагменты ДНК (до 2,3 Мб!). Кроме того, данная технология позволяет проводить секвенирование в реальном времени для нативной ДНК или РНК и даже получать информацию по модификациям нуклеотидов (метилирование).

Oxford Nanopore DNA sequencing облегчает также задачу полногеномного секвенирования благодаря использованию длинных прочтений. С помощью этой технологии можно расшифровывать последовательности с нестандартными ГЦ-составом или множеством повторов. Для вирусов и плазмид возможно геномное секвенирование за одно прочтение. Преимущество, особенно важное для использовании в вирусологии — возможность прямой расшифровки геномов РНК-вирусов, без предварительного получения кДНК.

Секвенаторы Oxford Nanopore еще и очень удобны в использовании практически везде, в том числе при полевой работе, в отсутствии хорошо оснащенной лаборатории. Так, например, секвенатор MiniION отличается компактным размером (помещается в руку). Время приготовления образца составляет около 10 минут; для этого существует удобный набор реагентов с простой инструкцией. Секвенатор можно напрямую подключать к компьютеру, как флешку, чтобы проанализировать полученные данные. Цена такого секвенатора и анализа в целом очень низка.

Запросить информацию и купить секвенатор ДНК можно на сайте (https://www.skygen.com/katalog/oborudovanie/oxford_nanopore_technologies/nanoporovyy_sekvenator_minion/). Посмотреть и купить другие секвенаторы для расшифровки ДНК можно в разделе Oxford Nanopore Technologies (https://www.skygen.com/katalog/oborudovanie/oxford_nanopore_technologies/). Кроме масштабированных секвенаторов, позволяющих прочитать большее количество ДНК, в этом разделе можно найти и автоматизированную станцию пробоподготовки VolTRAX V2.