Нанопоровый секвенатор MinION

MinION – портативный высокопроизводительный нанопоровый секвенатор производства Oxford Nanopore Technologies, предназначенный для запуска одной стандартной проточной ячейки R9 или R10.

Главные преимущества MinION

• Относится к 3-му поколению NGS-секвенаторов,
• Простая и быстрая пробоподготовка без амплификации,
• Длинные прочтения без ограничения по длине,
• Максимальная производительность до 30 млрд. нуклеотидов,
• Низкая стоимость прочтения одного нуклеотида,
• Возможность отслеживать параметры, контролировать процесс секвенирования и проводить бейсколлинг в реальном времени,
• Прибор очень легкий (87 г) и компактный (105 х 33 х 23 мм),
• Мобильность: для работы прибора не требуется особого помещения, его можно использовать в «полевых» условиях и перемещать даже во время работы,
• Управление осуществляется с помощью ноутбука, стационарного компьютера или компактного управляющего модуля MinIT,
• Возможность остановки запуска в любой момент времени,
• Прибор питается от управляющей станции и не требует специального источника бесперебойного питания.

Области применения MinION

• Полногеномное секвенирование de novo и ресеквенирование,
• Облегчение сборки данных, полученных на других секвенаторах,
• Детекция хромосомных аббераций,
• Исследование альтернативного сплайсинга,
• Определение копийности определенных последовательностей,
• Анализ экспрессии генов,
• Углубленное исследование образцов бактериального метагенома (с предварительной амплификацией полного гена 16S рРНК),
• Детекция модифицированных нуклеотидов,
• Анализ профиля метилирования и др.

Технология нанопорового секвенирования

Ключевым компонентом (и основным расходным материалом) нанопровых секвенаторов является проточная ячейка.

Процесс секвенирования происходит в камере ячейки, содержащей непроводящую мембрану, в которую встроены проводящие белковые нанопоры. Обе стороны мембраны омывают растворы электролитов.

Во время пробоподготовки к концам фрагментов нуклеиновых кислот пришиваются специальные моторные белки. При попадании образца в камеру проточной ячейки эти белки связываются с нанопорами.

При запуске прибора между сторонами мембраны возникает разность потенциалов. Под действием электрического поля и при участии молекул АТФ моторные белки расплетают двухцепочечную нуклеиновую кислоту и направляют одну из цепей в нанопору. (При этом вторая цепь может присоединиться к соседней поре либо остаться в растворе.)

Дальнейшее движение фрагмента нуклеиновой кислоты через канал осуществляется за счет его отрицательного заряда. Одновременно с исследуемой молекулой под напряжением через нанопоры движутся ионы, содержащиеся в растворах электролитов. Поскольку размер нуклеотидов неодинаков, величина ионного тока зависит от последовательности участка нуклеиновой кислоты, проходящего через канал в данный момент времени. В ходе секвенирования происходит регистрация этого тока.

Таким образом, первичные данные нанопорового секвенирования представляют собой совокупность скачков силы тока ионов.

После секвенирования одного фрагмента нанопора остается активной и может аналогично пропустить через себя множество других цепей нуклеиновых кислот.

Бейсколлинг – распознавание нуклеотидов по исходному сигналу – осуществляет специальное программное обеспечение.

Видеообзор принципа нанопопрового секвенирования

Управление MinION

Через порт USB 3.0 секвенатор MinION может быть подключен к управляющему ноутбуку или стационарному компьютеру, удовлетворяющему следующим характеристикам:

1. ОС Windows – 7, 8, 10, macOS – Sierra, High Sierra, ОС Linux – Ubuntu 14.04 или 16.04 ,
2. Оперативная память: 16 Гб,
3. Центральный процессор (CPU): Intel i7 или Xeon (4+ ядер),
4. Встроенный SSD-диск: 1 Тб,
5. Порт: USB 3.0,
6. Наличие Интернет-подключения,
7. Порт Ethernet: HTTPS/port 443 и HTTP/port 80 TCP доступ к IP-адресам с хостингом Linode 178.79.175.200, 96.126.99.215 и 106.187.40.102,
8. Для стационарного компьютера: наличие монитора, клавиатуры и мыши.

Также управлять прибором можно с помощью модуля MinIT производства Oxford Nanopore Technologies. Эта компактная станция содержит все необходимое для работы с MinION, включая программное обеспечение для первичной и вторичной обработки данных.

MinIT не имеет дисплея, но посредством Wi-Fi или Bluetooth можно подключить любое цифровое устройство с дисплеем для отображения интерфейса программного обеспечения: планшетный компьютер, ноутбук или смартфон. Используя внешний Wi-Fi модуль, подключенный к стационарному компьютеру, можно также подключиться к MinIT.

В случае, если памяти внутреннего накопителя будет недостаточно, к MinIT можно подключить внешний SSD-диск.

Программное обеспечение

Программа MinKNOW контролирует температуру камеры проточной ячейки во время секвенирования (+34° С), величину напряжения (варьирует в зависимости от длительности запуска), регистрирует и сохраняет в формате .FAST5 данные о величине ионного тока через нанопоры, а также позволяет проводить бейсколлинг в реальном времени. Интерфейс MinKNOW отображает количество прочтений, их длину, процент работающих пор и другие характеристики запуска.

Дополнительная программа Guppy предназначена для бейсколлинга по итогам запуска в режиме offline.

ПО MinKNOW и Guppy можно скачать бесплатно в личном кабинете на сайте Oxford Nanopore Technologies.

Первичные данные, получаемые на MinION, позволяют не только определить последовательность нуклеиновых кислот, но и получить информацию о содержании в них модифицированных нуклеотидов. Обработав эти данные специальным ПО, можно без дополнительной ручной работы с биоматериалом изучить профиль метилирования ДНК.

Также пользователи продукции Oxford Nanopore Technologies могут воспользоваться облачным сервисом EPI2ME от портала Metrichor, содержащим большое количество программных модулей (pipelines) для вторичной обработки данных.

Стартовая комплектация прибора

Видеообзор нанопорового секвенатора MinION