Реактивы, оборудование и
расходные материалы
для лабораторий
English version
пн-пт: 9:30-18:00 по МСК
0

#39 Протокол ARTIC: нанопоровое секвенирование вирусов

31.05.2021

Эпидемия COVID-19, охватившая нашу планету, стала очень ярким примером того какие последствия может нести случайная мутация или смена хозяина вируса, то есть процесс его эволюции. 

Эволюция вируса – это накопление точечных мутаций в его геноме, возникающих при многократном самореплицировании: процессе копирования наследственной информации, с помощью которого размножается вирус. Большинство этих мутаций не влияют на свойства вируса, но некоторые могут оказаться очень значимыми и менять механизм и скорость его передачи, а также характер течения заболевания.

SARS-CoV-2 достаточно хорошо изучен: были разработаны лекарства и вакцины, и в настоящий момент население активно иммунизируют. Однако, вирус продолжает развиваться и неизвестно, будет ли приобретенный иммунитет эффективен в отношении новых мутантных форм. В связи с этим с самого начала эпидемии Всемирная Организация Здравоохранения сотрудничает с лабораториями по всему миру для обнаружения и отслеживания распространения новых вариантов вируса. В этом обзоре мы обсудим методы, которые учёные используют для исследования и поиска мутаций вирусов в лабораториях (и не только).

ARTIC network

Время от времени в разных частях света возникают вспышки опасных вирусных заболеваний, однако многие удаётся локализовать и предотвратить возникновение пандемии. Например, птичий грипп (H5N1) в 2005 году удалось сдержать, благодаря массовому забою и вакцинации домашних птиц1. Лихорадку Эбола, также удалось локализовать, не дав распространиться по всему миру2. Всё это стало возможно благодаря слаженной работе врачей и быстрой оценки эпидемиологической ситуации с помощью методов молекулярной биологии.

ARTIC network (Advancing Real Time Infection Control) - это международный консорциум исследователей. Целью проекта является разработка сквозной системы обработки образцов из эпицентров вспышек вирусных заболеваний для немедленного реагирования со стороны органов здравоохранения.

Быстро эволюционирующие РНК-вирусы (такие как Эбола, SARS-CoV-2, грипп и т. д.) постоянно накапливают изменения в своих геномах, которые можно использовать для реконструкции процессов, вызывающих эпидемию. На сайте ARTIC в свободном доступе находятся подробные протоколы, описывающие все этапы исследования вируса от рекомендаций по забору и транспортировке материала до алгоритмов обработки результатов. Своевременное использование методов молекулярной эпидемиологии помогает выбрать наиболее подходящий путь реагирования на вспышки заболеваемости.

Вот как сами участники консорциума описывают свою работу: «Основываясь на технологии работы портативного прибора для секвенирования Oxford Nanopore Technology MinION , мы создаем «лабораторию в чемодане», которую можно развернуть в удаленных местах с ограниченными ресурсами. Генерация сиквенсных данных тесно связана с платформой для их анализа и интеграции эпидемиологических знаний для выявления процессов передачи, эволюции вируса и эпидемиологической угрозы в чрезвычайно быстро изменяющихся условиях. Такой подход работы в режиме реального времени способен предоставить действенную эпидемиологическую информацию в течение нескольких дней после взятия проб у пациентов.»

Методы поиска новых мутаций

Для поиска новых мутаций необходимо провести полногеномное секвенирование вируса. Самые популярные технологии для решения этой задачи на сегодняшний день - это платформа Illumina и нанопоровое секвенирование на приборах Oxford Nanopore Technologies.

Каждый из подходов имеет свои достоинства и недостатки. Так как геном вируса сравнительно небольшой, проводить расшифровку на приборах Illumina, заточенных под чтение коротких фрагментов, кажется весьма оправданным. И поскольку эта технология уже не новая, многие лаборатории имеют всё необходимое оборудование и опыт работы на приборах этого типа. Однако, есть и некоторые ограничения: секвенаторы тяжело транспортировать, а также стоимость одного запуска довольно высокая.

В то же время приборы компании ONT более компактные, габариты MinION не превышают размера современного смартфона. , его удобно использовать в передвижных лабораториях. В случае, если исследователь видит, что данных уже достаточно для интерпретации, реакцию можно остановить, промыть ячейку и загрузить новой библиотекой повторно. Такой подход сэкономит не только деньги, но и время, что критически важно в условиях возникающей эпидемии. Именно из-за этих преимуществ, разработанные протоколы ARTIC изначально ориентированы на использование нанопорового секвенирования, однако адаптированы и под приборы Illumina.

Готовые решения для секвенирования SARS-CoV-2.

Первый протокол ARTIC, описывающий метод исследования коронавируса нового типа, появился 22 января 2020 года, всего через месяц после выявления первого случая заболевания. В нем описан метод полногеномного секвенирования ампликонов c мультиплексированием и указаны все необходимые реагенты, буферы и последовательности праймеров. С тех пор протокол немного усовершенствовался, и более того были разработаны готовые наборы реактивов для подготовки образцов к секвенированию.

Компания New England Biolabs разработала наборы NEBNext ARTIC для подготовки библиотек для полногеномного секвенирования SARS-CoV-2. Всего в этой линейке три набора: два для работы на Illumina и один для работы с ONT. Подробнее об особенностях каждого из наборов можно узнать на соответствующих страницах нашего сайта. 

Наборы NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 от New England Biolabs:

Преимущества наборов NEBNext ARTIC SARS-CoV-2

Разработка наборов велась при поддержке специалистов ARTIC network и ONT. В основу работы лег оригинальный протокол ARTIC3, таким образом команде NEB удалось разработать реагенты максимально подходящие под поставленную задачу. 

Первым преимуществом использования готовых наборов стоит назвать сбалансированность всех реагентов. Специально подобранные буферные системы и смеси ферментов позволяют снизить количество этапов пипетирования и очистки реакции, которые могут привести к нежелательной контаминации и потере образца.

workflow ARTIC.jpg

Другая важная деталь — это праймеры, входящие в состав набора. В каждый набор NEBNext ARTIC включены пары праймеров комплиментарные как наиболее консервативным областям генома SARS-CoV-2, так и некоторым участкам РНК человека, для осуществления внутреннего контроля образца. Последовательности нуклеотидов в праймерах такие же, как и в протоколе ARTIC, однако, они обладают улучшенным молекулярным строением и позволяют получить более глубокое покрытие при секвенировании.

Высокий выход ОТ-ПЦР амплификации SARS-CoV-2 с наборами NEBNext ARTIC.png

Высокий выход ОТ-ПЦР амплификации SARS-CoV-2 с наборами NEBNext ARTIC. Ампликоны были получены из 10 - 10 000 копий  вирусной РНК SARS-CoV-2 (ATCC VR-1986 и VR-1991) в 100 нг универсальной референсной РНК человека (ThermoFisher QS0639) с использованием сбалансированных пулов праймеров ARTIC SARS-CoV-2 NEBNext. Средний выход ампликонов измеряли с использованием набора Qubit ™ dsDNA BR Assay Kit (ThermoFisher Q32850).

Улучшение покрытия генома с модулем NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Oxford Nanopore Technologies..png

Улучшение покрытия генома с модулем NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Oxford Nanopore Technologies. Визуализация Integrative Genome Viewer покрытия генома SARS-CoV-2. Ампликоны были созданы из 1 000 копий вирусной РНК SARS-CoV-2 (ATCC VR-1986 и VR-1991) в 100 нг универсальной референсной РНК человека (ThermoFisher QS0639) с использованием панели IDT ARTIC nCoV-2019 V3 («Standard») или сбалансированных пулов праймеров ARTIC SARS-CoV-2 NEBNext. Библиотеки были созданы с использованием набора NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 (Oxford Nanopore Technologies) и наборов ONT Native Barcoding Expansion 1-12 (EXP-NBD104) и 13-24 (EXP-NBD114), Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK109) и SFB Expansion Kit (EXP-SFB001).Секвенирование осуществлялось на приборе GridION с использованием проточных ячеек R9.4.1, и пайплайна ARTIC Network nCoV-19.

Кроме того, в наборах линейки NEBNext используется самая точная полимераза Q5, которая допускает в 280 раз меньше ошибок по сравнению со стандартной Taq полимеразой. Готовые смеси для амплификации библиотек секвенирования с этой полимеразой включены в набор, а также их можно приобрести в виде отдельного модуля.

А что дальше?

Когда данные секвенирования вируса получены и обработаны биоинформатиками, последовательность добавляют в одну из открытых баз данных. ВОЗ сотрудничает с такими центрами по всему миру и агрегирует эту информацию, в том числе с помощью системы GISAID. На этом сайте можно найти много интерактивных карт с информацией об обнаружении новых вариантов вируса и их распространении. Например, на этой карте можно проследить как мутировал SARS-CoV-2 за все время эпидемии и посмотреть географию распространения различных вариантов вируса.

GISAID.jpg

Список литературы

  1. Proença-Módena J. L., Macedo I. S., Arruda E. H5N1 avian influenza virus: an overview //Brazilian Journal of Infectious Diseases. – 2007. – Т. 11. – №. 1. – С. 125-133.
  2. Tseng C. P., Chan Y. J. Overview of Ebola virus disease in 2014 //Journal of the Chinese Medical Association. – 2015. – Т. 78. – №. 1. – С. 51-55.
  3. Josh Quick 2020. nCoV-2019 sequencing protocol v2 (GunIt)

© 2012-2021 SkyGen
Информация и цены на сайте не являются публичной офертой