#39 Протокол ARTIC: нанопоровое секвенирование вирусов

Эпидемия COVID-19, охватившая нашу планету, стала очень ярким примером того какие последствия может нести случайная мутация или смена хозяина вируса, то есть процесс его эволюции. 

Эволюция вируса – это накопление точечных мутаций в его геноме, возникающих при многократном самореплицировании: процессе копирования наследственной информации, с помощью которого размножается вирус. Большинство этих мутаций не влияют на свойства вируса, но некоторые могут оказаться очень значимыми и менять механизм и скорость его передачи, а также характер течения заболевания.

SARS-CoV-2 достаточно хорошо изучен: были разработаны лекарства и вакцины, и в настоящий момент население активно иммунизируют. Однако, вирус продолжает развиваться и неизвестно, будет ли приобретенный иммунитет эффективен в отношении новых мутантных форм. В связи с этим с самого начала эпидемии Всемирная Организация Здравоохранения сотрудничает с лабораториями по всему миру для обнаружения и отслеживания распространения новых вариантов вируса. В этом обзоре мы обсудим методы, которые учёные используют для исследования и поиска мутаций вирусов в лабораториях (и не только).

ARTIC network

Время от времени в разных частях света возникают вспышки опасных вирусных заболеваний, однако многие удаётся локализовать и предотвратить возникновение пандемии. Например, птичий грипп (H5N1) в 2005 году удалось сдержать, благодаря массовому забою и вакцинации домашних птиц¹. Лихорадку Эбола, также удалось локализовать, не дав распространиться по всему миру². Всё это стало возможно благодаря слаженной работе врачей и быстрой оценки эпидемиологической ситуации с помощью методов молекулярной биологии.

ARTIC network (Advancing Real Time Infection Control) - это международный консорциум исследователей. Целью проекта является разработка сквозной системы обработки образцов из эпицентров вспышек вирусных заболеваний для немедленного реагирования со стороны органов здравоохранения.

Быстро эволюционирующие РНК-вирусы (такие как Эбола, SARS-CoV-2, грипп и т. д.) постоянно накапливают изменения в своих геномах, которые можно использовать для реконструкции процессов, вызывающих эпидемию. На сайте ARTIC в свободном доступе находятся подробные протоколы, описывающие все этапы исследования вируса от рекомендаций по забору и транспортировке материала до алгоритмов обработки результатов. Своевременное использование методов молекулярной эпидемиологии помогает выбрать наиболее подходящий путь реагирования на вспышки заболеваемости.

Вот как сами участники консорциума описывают свою работу: «Основываясь на технологии работы портативного прибора для секвенирования Oxford Nanopore Technology MinION , мы создаем «лабораторию в чемодане», которую можно развернуть в удаленных местах с ограниченными ресурсами. Генерация сиквенсных данных тесно связана с платформой для их анализа и интеграции эпидемиологических знаний для выявления процессов передачи, эволюции вируса и эпидемиологической угрозы в чрезвычайно быстро изменяющихся условиях. Такой подход работы в режиме реального времени способен предоставить действенную эпидемиологическую информацию в течение нескольких дней после взятия проб у пациентов.»

Методы поиска новых мутаций

Для поиска новых мутаций необходимо провести полногеномное секвенирование вируса. Самые популярные технологии для решения этой задачи на сегодняшний день - это платформа Illumina и нанопоровое секвенирование на приборах Oxford Nanopore Technologies.

Каждый из подходов имеет свои достоинства и недостатки. Так как геном вируса сравнительно небольшой, проводить расшифровку на приборах Illumina, заточенных под чтение коротких фрагментов, кажется весьма оправданным. И поскольку эта технология уже не новая, многие лаборатории имеют всё необходимое оборудование и опыт работы на приборах этого типа. Однако, есть и некоторые ограничения: секвенаторы тяжело транспортировать, а также стоимость одного запуска довольно высокая.

В то же время приборы компании ONT более компактные, габариты MinION не превышают размера современного смартфона. , его удобно использовать в передвижных лабораториях. В случае, если исследователь видит, что данных уже достаточно для интерпретации, реакцию можно остановить, промыть ячейку и загрузить новой библиотекой повторно. Такой подход сэкономит не только деньги, но и время, что критически важно в условиях возникающей эпидемии. Именно из-за этих преимуществ, разработанные протоколы ARTIC изначально ориентированы на использование нанопорового секвенирования, однако адаптированы и под приборы Illumina.

Готовые решения для секвенирования SARS-CoV-2.

Первый протокол ARTIC, описывающий метод исследования коронавируса нового типа, появился 22 января 2020 года, всего через месяц после выявления первого случая заболевания. В нем описан метод полногеномного секвенирования ампликонов c мультиплексированием и указаны все необходимые реагенты, буферы и последовательности праймеров. С тех пор протокол немного усовершенствовался, и более того были разработаны готовые наборы реактивов для подготовки образцов к секвенированию.

Компания New England Biolabs разработала наборы NEBNext ARTIC для подготовки библиотек для полногеномного секвенирования SARS-CoV-2. Всего в этой линейке три набора: два для работы на Illumina и один для работы с ONT. Подробнее об особенностях каждого из наборов можно узнать на соответствующих страницах нашего сайта. 

Наборы NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 от New England Biolabs:

• Набор NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 для подготовки библиотек (Illumina®); 
• Набор NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS c фрагментазой для подготовки библиотек (Illumina®);
• Модуль NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 для подготовки библиотек (Oxford Nanopore Technologies).

Преимущества наборов NEBNext ARTIC SARS-CoV-2

Разработка наборов велась при поддержке специалистов ARTIC network и ONT. В основу работы лег оригинальный протокол ARTIC³, таким образом команде NEB удалось разработать реагенты максимально подходящие под поставленную задачу. 

Первым преимуществом использования готовых наборов стоит назвать сбалансированность всех реагентов. Специально подобранные буферные системы и смеси ферментов позволяют снизить количество этапов пипетирования и очистки реакции, которые могут привести к нежелательной контаминации и потере образца.

Другая важная деталь — это праймеры, входящие в состав набора. В каждый набор NEBNext ARTIC включены пары праймеров комплиментарные как наиболее консервативным областям генома SARS-CoV-2, так и некоторым участкам РНК человека, для осуществления внутреннего контроля образца. Последовательности нуклеотидов в праймерах такие же, как и в протоколе ARTIC, однако, они обладают улучшенным молекулярным строением и позволяют получить более глубокое покрытие при секвенировании.

Высокий выход ОТ-ПЦР амплификации SARS-CoV-2 с наборами NEBNext ARTIC. Ампликоны были получены из 10 - 10 000 копий  вирусной РНК SARS-CoV-2 (ATCC VR-1986 и VR-1991) в 100 нг универсальной референсной РНК человека (ThermoFisher QS0639) с использованием сбалансированных пулов праймеров ARTIC SARS-CoV-2 NEBNext. Средний выход ампликонов измеряли с использованием набора Qubit ™ dsDNA BR Assay Kit (ThermoFisher Q32850).

Улучшение покрытия генома с модулем NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Oxford Nanopore Technologies. Визуализация Integrative Genome Viewer покрытия генома SARS-CoV-2. Ампликоны были созданы из 1 000 копий вирусной РНК SARS-CoV-2 (ATCC VR-1986 и VR-1991) в 100 нг универсальной референсной РНК человека (ThermoFisher QS0639) с использованием панели IDT ARTIC nCoV-2019 V3 («Standard») или сбалансированных пулов праймеров ARTIC SARS-CoV-2 NEBNext. Библиотеки были созданы с использованием набора NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 (Oxford Nanopore Technologies) и наборов ONT Native Barcoding Expansion 1-12 (EXP-NBD104) и 13-24 (EXP-NBD114), Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK109) и SFB Expansion Kit (EXP-SFB001).Секвенирование осуществлялось на приборе GridION с использованием проточных ячеек R9.4.1, и пайплайна ARTIC Network nCoV-19.

Кроме того, в наборах линейки NEBNext используется самая точная полимераза Q5, которая допускает в 280 раз меньше ошибок по сравнению со стандартной Taq полимеразой. Готовые смеси для амплификации библиотек секвенирования с этой полимеразой включены в набор, а также их можно приобрести в виде отдельного модуля.

А что дальше?

Когда данные секвенирования вируса получены и обработаны биоинформатиками, последовательность добавляют в одну из открытых баз данных. ВОЗ сотрудничает с такими центрами по всему миру и агрегирует эту информацию, в том числе с помощью системы GISAID. На этом сайте можно найти много интерактивных карт с информацией об обнаружении новых вариантов вируса и их распространении. Например, на этой карте можно проследить как мутировал SARS-CoV-2 за все время эпидемии и посмотреть географию распространения различных вариантов вируса.

Список литературы

1. Proença-Módena J. L., Macedo I. S., Arruda E. H5N1 avian influenza virus: an overview //Brazilian Journal of Infectious Diseases. – 2007. – Т. 11. – №. 1. – С. 125-133.
2. Tseng C. P., Chan Y. J. Overview of Ebola virus disease in 2014 //Journal of the Chinese Medical Association. – 2015. – Т. 78. – №. 1. – С. 51-55.
3. Josh Quick 2020. nCoV-2019 sequencing protocol v2 (GunIt)