#29 Редактирование геномов

CRISPR (от англ. «Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats») – это локусы повторяющихся коротких повторов (18-50 н.п.), разделённых уникальными спейсерными последовательностями (17-84 н.п.), встречающиеся в геномах бактерий и архей.

В непосредственной близости от локусов CRISPR располагаются гены так называемых Cas-белков (от англ. «CRISPR-assosiated») и последовательность, кодирующая tracrРНК (trans-activating CRISPR РНК).

Установлено, что основная функция CRISPR/Cas систем в организмах прокариот – адаптивный иммунный ответ на вторжение ДНК плазмид и бактериофагов.

Последовательность уникальных спейсеров в локусах CRISPR (разноцветные шестиугольники на Рис.1) совпадают с фрагментами чужеродной ДНК, с которой клетка (или её предшественники) когда-либо сталкивалась.

Рис. 1. Схема адаптивного иммунного ответа на примере системы CRISPR/Cas9.¹

Иммунный ответ запускается в тот момент, когда в бактерию или архею проникает ДНК фага или плазмиды. В случае CRISPR/Cas9 системы (Рис. 1) происходят следующие события:

1. Транскрипция локуса CRISPR с образованием pre-crРНК (pre-CRISPR РНК).
2. Транскрипция гена Cas9 и синтез соответствующего белка.
3. Транскрипция участка, кодирующего tracrРНК.
4. tracrРНК взаимодействует с повторами в pre-crРНК за счёт частичной комплементарности.
5. Белки Cas9 стабилизируют образовавшиеся двухцепочечные РНК-структуры, а РНКаза III их расщепляет. При этом pre-crРНК превращается несколько crРНК, которые гибридизованы с tracrРНК. И на своем 5’-конце crРНК несут последовательности спейсеров длиной 20 н.п. из CRISPR-локуса.
6. Гибриды tracrРНК/crРНК направляют белки Cas9 к чужеродной ДНК.
7. Нуклеаза Cas9 связывается с так называемым PAM-мотивом (от англ. «protospacer adjacent motif»), являющимся для нее сайтом узнавания в дцДНК.
8. После связывания Cas9 расплетает цепи ДНК в направлении 3’-5’ от PAM-мотива. И если оказывается, что минус цепь комплементарна спейсерной последовательности на 5’-конце crРНК, то нуклеаза вносит в ДНК двухцепочечный разрыв на расстоянии 3 н.п. от мотива PAM.

Если же клетка никогда не сталкивалась с данным бактериофагом или плазмидой, то подобного расщепления не происходит. Но при этом другие белки Cas встраивают фрагменты чужеродной ДНК в локусы CRISPR². И при повторной встрече с патогеном, активируется иммунный ответ

Уникальная способность гибридов tracrРНК/crРНК программировать работу нуклеаз Cas9 не могла остаться незамеченной специалистами, занимающимися разработкой методов геномного редактирования.

Ведь по сути, одним и тем же ферментом Cas9 можно направленно расщепить совершенно разные участки ДНК с PAM-мотивом. Для этого достаточно, чтобы последовательность спейсера в составе tracrРНК/crРНК совпадал с целевой последовательностью ДНК.

Более того, оказалось, что такая система будет работать, даже если искусственным путём объединить tracrРНК и crРНК в единую укороченную РНК-химеру, получившую название гидовой РНК (sgРНК - от англ. «single guide РНК»)⁴.

В 2012-2013 гг. были опубликованы первые работы, авторам которых удалось осуществить сайт-специфическое расщепление ДНК в клетках эукариот с помощью компонентов CRISPR/Cas9 системы.

Что же происходит после того, как нуклеаза Cas9 вносит двухцепочечный разрыв в геном живой клетки?

Рис. 2. Варианты репарационных механизмов, активирующихся после двухцепочечного разрыва ДНК.⁸

Основной механизм репарации такого разрыва - негомологичное соединение концов (NHEJ). Он очень неточен и в подавляющем числе случаев сопровождается образованием инсерций и/или делеций в месте стыковки. Репарация NHEJ внутри экзона может привести к сдвигу рамки считывания, образованию преждевременного стоп-кодона и, в конечном итоге, к нокауту гена (Рис. 3)

Если же у клетки есть образец для восстановления последовательности (например, сестринская хроматида в поздней S- и G2-фазах клеточного цикла), то репарация пойдет также по пути гомологичной рекомбинации (HDR)

Кроме того, можно предоставить клетке и свой образец ДНК (донорную ДНК). Его концы должны быть гомологичны свободным концам ДНК, образовавшимся в результате разрыва. Таким образом можно заменить отдельные нуклеотиды в целевой последовательности или внести необходимую инсерцию (Рис. 3)

Рис. 3. Возможные результаты геномного редактирования с помощью сайт-специфических нуклеаз.¹

Даже в присутствии донорной ДНК эффективность репарации по механизму HDR значительно уступает эффективности репарации NHEJ. Чтобы увеличить вероятность гомологичной рекомбинации, специалисты тестируют разные подходы, например, ингибирование пути NHEJ, синхронизация клеточных линий в одинаковой фазе клеточного цикла, использование клеточных линий, дефицитных по компонентам NHEJ.¹

Две основные альтернативные технологии редактирования генома - ZFN и TALEN - заключаются в использовании химерных нуклеаз, состоящих из ДНК-связывающих и ДНКазных доменов.

В случае нуклеаз ZFN (от англ. «zink-finger nucleases») в качестве ДНК-связывающих доменов используют цинковые пальцы, каждый из которых способен узнать последовательность из трех нуклеотидов. В роли ДНКазного домена выступает каталитический домен рестриктазы FokI.

Поскольку фермент FokI функционирует только в виде димера, то для редактирования конкретного участка генома необходимо создать две нуклеазы ZFN (Рис. 4).

Распознавание тринуклеотидов цинковыми пальцами нельзя назвать строгим. Поэтому частота расщепления ДНК в нецелевых участках относительно высока.

Рис. 4. Устройство нуклеаз ZFN.¹

В случае нуклеаз TALEN (от англ. «Transcription Activator-like Effector Nucleases») также используется каталитический домен рестриктазы FokI. За связывание же с целевым участком ДНК отвечают домены на основе белков TALE (от англ. «Transcription Activator-like Effectors»), каждый из которых узнает один нуклеотид. Такая система более специфична, по сравнению с ZFN.

Рис. 5. Устройство нуклеаз TALEN.¹

Для создания нуклеаз ZFN и TALEN исследователь должен владеть широким спектром методов генной инженерии и иметь немалый практический опыт. К тому же, каждый новый проект по редактированию требует разработки, как минимум, двух новых ферментов

В случае же CRISPR/Cas систем для изменения специфичности нуклеазы достаточно всего лишь синтезировать другую гидовую РНК. Сравнение технологий по другим характеристикам см. в Табл. 1.

Таблица 1. Сравнение харатеристик технологий ZFN, TALEN и CRISPR/Cas.²

В настоящее время исследователи используют для редактирования геномов не только нативные нуклеазы Cas9 различных видов прокариот, но и их модифицированные варианты (Табл. 2). Также всё большую популярность приобретают белки Cas12a, а также белки Cas13, которые при участии sgРНК способны связываться и расщеплять молекулы РНК.

Таблица 2. Примеры белков Cas9, используемых в протоколах CRISPR/Cas.⁹

Отдельно стоит выделить две мутантные формы белка Cas9 Streptococcus pyogenes – nCas9 и dCas9.

В состав нативного SpCas9 входят два нуклеазных домена – HNH и RuvC. Каждый из них расщепляет только одну строго определённую цепь ДНК.

Если один из доменов инактивирован, то фермент превратится в никазу (nCas9). Обычно этого добиваются, внося мутацию D10A в домен HNH или мутацию H840A в домене RuvC.

Для редактирования генома в таком случае приходится подбирать два рядом лежащих целевых ДНК-участка и, соответственно, две sgРНК (Рис.6).

В результате одновременной обработки двумя никазами в ДНК появляются два ника. В отсутствии донорной ДНК они восстанавливаются по механизму репарации однонитевых разрывов (SSBR). Но если клетке предоставить образец, то дополнительно запустится механизм гомологичной рекомбинации HDR.¹⁰

При использовании никаз количество нуклеотидов, которые должны распознать рибонуклеопротеиновые комплексы, в два раза больше, чем при стандартной схеме. Таким образом удаётся существенно увеличить специфичность CRISPR/Cas системы и снизить частоту нецелевых событий редактирования.

Рис. 6. Принцип редактирования генома с помощью никаз nCas9.⁸

Нуклеаза Cas9, S. pyogenes - нативная РНК-зависимая ДНК-эндонуклеаза Cas9 Streptococcus pyogenes. Катализирует сайт-специфическое расщепление дцДНК за 3 нуклеотида до PAM-мотива (5’-NGG-3’). При этом PAM-мотив должен следовать за целевым участком ДНК, а 5’-конец гидовой РНК должен быть комплементарен минус-цепи целевого участка. Идеально подходит для расщепления дцДНК in vitro.

Нуклеаза EnGen® Spy Cas9 NLS  - модифицированная форма нуклеазы Cas9 S. pyogenes. Содержит на N- и С-концах сигналы ядерной локализации (NLS) T-антигена вируса SV40, облегчающие проникновение комплексов Cas9/sgРНК в ядра клеток. Идеально подходит для расщепления дцДНК in vitro.

Нуклеаза EnGen® Sau Cas9 - нативная РНК-зависимая ДНК-эндонуклеаза Staphylococcus aureus. Катализирует сайт-специфическое расщепление дцДНК за 3 нуклеотида до PAM-мотива (5’-NNGRRT-3’). При этом PAM-мотив должен следовать за целевым участком ДНК, а 5’-конец гидовой РНК должен быть комплементарен минус-цепи целевого участка.

Никаза EnGen® Spy Cas9 - модифицированная форма нуклеазы EnGen® Spy Cas9 NLS с точечной мутацией (D10A) в нуклеазном домене RuvC и сигналами ядерной локализации (NLS) T-антигена вируса SV40 на N- и C-концах. Фермент способен только никировать дцДНК. Для редактирования генома требуется подбор двух целевых участков и двух sgРНК.

EnGen® Spy dCas9 (SNAP-tag®) - модифицированная форма нуклеазы EnGen® Spy Cas9 NLS с инактивированными нуклеазными доменами. При этом белок сохраняет РНК-зависимую ДНК-связывающую активность. На N-конце EnGen® Spy dCas9 (SNAP-tag®) присутствует метка SNAP-tag®, с которой могут ковалентно взаимодействовать флуорофоры, биотин и ряд других субстратов.

Нуклеаза EnGen® Lba Cas12a (Cpf1) - РНК-зависимая ДНК-эндонуклеаза Cas12a Lachnospiraceae bacterium. Катализирует сайт-специфическое расщепление дцДНК через ~18 нуклеотидов после PAM-мотива (5’-TTTN-3’). При этом целевой участок ДНК должен следовать за PAM-мотивом, а 3’-конец гидовой РНК должен быть комплементарен минус-цепи целевого участка. Продукты расщепления нуклеазой EnGen® Lba Cas12a (Cpf1) имеют 5’-липкие концы.

Фермент направляется более короткой, чем в случае Cas9, гидовой РНК (40-44 н.). На N- и С-концах он содержит сигналы ядерной локализации (NLS), облегчающие проникновение комплексов Cas12a/sgРНК в ядра клеток.

Нуклеаза активна в диапазоне температур от 16°C до 48°C и подходит для редактирования геномов холоднокровных организмов, например Danio rerio и Xenopus.

Задача по доставке компонентов CRISPR/Cas в исследуемый объект состоит из двух частей. Во-первых, надо определить, в какой форме лучше всего доставлять нуклеазу Cas, sgРНК и, в случае необходимости, донорную ДНК. А во-вторых – каким способом.

Что касается формы, то sgРНК можно доставлять в готовом виде, либо в составе экспрессионного ДНК-вектора под промотором, узнаваемым РНК полимеразой III (например, U6).

Нуклеазы Cas доставляют в живые клетки либо в виде белков, либо в виде мРНК, либо опять же в составе экспрессионного ДНК-вектора. В последнем случае кодоны в последовательности гена Cas должны быть оптимизированы в соответствии с предпочтениями исследуемого объекта.

Если сравнивать преимущества и недостатки различных форм доставки компонентов CRISPR/Cas, то самым предпочтительным вариантом оказывается использование готового белка Cas и синтезированной sgРНК (Табл. 3). Причем в живые клетки их вводят не по отдельности, а в виде заранее подготовленных рибонуклеопротеиновых комплексов Cas/sgРНК.

Таблица 3. Сравнение форм доставки компонентов CRISPR/Cas в живые системы.

Формы доставки
Эффективность редактирования	Низкая и вариабельная	Низкая и вариабельная	Высокая и повторяющаяся
Специфичность редактирования	Низкая	Высокая	Высокая
Скорость подготовки	Низкая	Средняя	Высокая
Скорость получения результата	Низкая	Средняя	Высокая
Нежелательное встраивание в геном	Возможно	Невозможно	Возможно
Стоимость	Очень низкая	Средняя	Низкая

Донорную ДНК можно доставлять в виде одноцепочечного ДНК-олигонуклеотида или в составе плазмиды.

В следующей таблице перечислены различные продукты New England Biolabs, которые могут быть полезны на разных этапах подготовки компонентов системы CRISPR/Cas.

О последнем продукте стоит рассказать немного подробнее, поскольку он существенно упрощает самостоятельный синтез sgРНК и оптимизирован для работы с белками Cas9 производства New England Biolabs.

Набор EnGen® для синтеза sgРНК, S. pyogenes

Данный набор предназначен для простого и быстрого синтеза 4-25 мкг гидовой РНК (sgРНК) с помощью входящих в комплект реагентов и таргет-специфичного ДНК-олигонуклеотида, подобранного пользователем. Получаемая таким образом sgРНК может управлять активностью следующих вариантов нуклеазы Cas9:

• Нуклеаза Cas9, S. pyogenes,
• Нуклеаза EnGen® Spy Cas9 NLS,
• Никаза EnGen® Spy Cas9,
• Белок EnGen® Spy dCas9 (SNAP-tag®).

Процесс синтеза sgРНК с помощью набора EnGen® состоит из следующих этапов:

1. Выбор целевого участка ДНК для редактирования,
2. Дизайн и заказ синтеза таргет-специфичного одноцепочечного
3. ДНК-олигонуклеотида длиной ~55 нуклеотидов,
4. Проведение самой реакции синтеза sgРНК с помощью набора EnGen®,
5. Обработка продуктов реакции ДНКазой I,
6. Очистка sgРНК и оценка выхода продукта.

Рис.7. Синтез сгРНК с помощью набора EnGen®.

Для подбора таргет-специфичного олигонуклеотида компания New England Biolabs разработала с пециальный онлайн-инструмент EnGen™ sgRNA Template Oligo Designer. Его 5’-конец должен содержать промотор фага T7, средняя часть - соответствовать целевой последовательности редактируемой ДНК, а 3’-конец - быть комплементарным 5’-концу скаффолд-олигонуклеотида, входящего в состав набора.

На первом этапе синтеза таргет-специфичный ДНК олигонуклеотид и скаффолд-олигонуклеотид отжигаются друг на друге. Затем происходит достройка вторых цепей этой конструкции с помощью ДНК-полимеразы. В результате последующей in vitro транскрипции и образуется sgРНК (Рис. 7).

Их разделяют на 3 основные группы:

• Физические способы: микроинъекции, электропорация, нуклеофекция, гидродинамические инъекции, биобаллистика.
• Химические методы: липосомы (трансфекция), пептиды, наноклубки, наночастицы золота и др.
• Доставка с помощью вирусных частиц на основе лентивирусов, герпесвирусов, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов.

Более подробно указанные способы доставки освещаются в публикации Lino C.A. et al.¹

Если говорить о растительных объектах, то стоит упомянуть такие методы, как трансформация с помощью агробактерий и Ti-плазмид, доставка с помощью вирусных систем (например, на основе геминивирусов), биобаллистика.

Оценивать результаты редактирования генома можно на трёх уровнях: ДНК, мРНК и белков.

Выбор метода анализа ДНК зависит от того, какие мутации вы хотели внести редактированием (см. Табл. 5).

Рестриктный анализ возможен в случае, если в целевом участке ДНК должен был появиться или, наоборот, исчезнуть сайт узнавания какой-либо рестриктазы.

Если в результате редактирования целевой участок должен был претерпеть достаточно длинные инсерции или делеции, то можно воспользоваться методом ПЦР и сравнить количества ампликонов разной длины.

Также для детекции инсерций и делеций, а также точечных мутаций подходит метод реал-тайм ПЦР с ДНК-зондами.

Секвенирование даст прямой ответ на вопрос, какие конкретно изменения произошли в целевом участке ДНК.

Таблица 5. Продукция New England Biolabs для анализа результатов редактирования геномов.

Еще один метод детекции мутаций после редактирования генома основан на использовании T7 эндонуклеазы I. И компания New England Biolabs предлагает специальный набор для такого анализа: набор EnGen® для детекции мутаций.

Принцип детекции мутаций заключается в способности T7 эндонуклеазы I распознавать и расщеплять в двухцепочечной ДНК участки неспаренных оснований длиной более 1 н.п.

Протокол анализа состоит из следующих этапов:

1. Высокоточная амплификация с помощью ПЦР участков геномной ДНК, подвергшихся редактированию. В качестве ДНК-полимеразы в данном наборе используется Q5® Hot Start HF ДНК-полимераза, являющаяся на сегодняшний день самым точным ферментом такого типа.
2. Денатурация и повторный отжиг друг на друге продуктов ПЦР. Поскольку в ходе редактирования участка генома в нём появляются инсерции и делеции, то на этом этапе протокола образуются гетеродуплексы, часть оснований которых не спарена.
3. Продукты предыдущей реакции обрабатываются T7 эндонуклеазой I. В результате фрагменты с полностью комплементарными друг другу цепями остаются интактными, а гетеродуплексы расщепляются с образованием более коротких продуктов.
4. Анализ продуктов расщепления T7 эндонуклеазой I c помощью гель-электрофореза или другими методами.

Рис. 8. Принцип детекции мутаций с помощью набора EnGen®.

Любой эксперимент по геномному редактированию состоит из следующих этапов: дизайн, подготовка компонентов CRISPR/Cas9, доставка компонентов CRISPR/Cas9, анализ результатов.

В предыдущих разделах мы уже рассмотрели основные варианты реализации этапов 2 - 4. Теперь, опираясь на эту информацию, мы можем резюмировать, что для успешного проведения эксперимента в ходе дизайна необходимо:

1. Сформулировать цель исследования: ответы на какие вопросы вы хотите получить в результате эксперимента?
2. Выбрать объект исследования: животные или растительные объекты, культуры клеток или модельный организм?
3. Определить, какие конкретно области генома вы будете редактировать: гены, промоторы, регуляторные элементы, некодирующие участки?
4. Выбрать тип редактирования: нокаут гена, нокин гена, точечные мутации, делеции, инсерции, никирование, редактирование оснований, активация/репрессия генов, эпигенетические модификации, мечение?
5. Определить, какие Cas белки подойдут для вашей цели: нативные Cas9, Cas12a, Cas13 или их мутантные формы?
6. Подобрать in silico целевые участки ДНК для редактирования и sgРНК.
7. Выбрать, в какой форме вы будете доставлять компоненты CRISPR/Cas в исследуемый объект: рибонуклеопротеиновый комплекс Cas + sgРНК, мРНК Cas + sgРНК, экспрессионные плазмиды с генами Cas и sgРНК.
8. Определиться с методом подготовки компонентов CRISPR/Cas и способом их доставки в исследуемый объект: физические способы, химические способы, вирусные частицы.
9. Подобрать подходящие контроли, прежде всего для системы доставки компонентов CRISPR/Cas.
10. Определиться с методами анализа результатов эксперимента: ПЦР/реал-тайм ПЦР, секвенирование, детекция мутаций с помощью T7 эндонуклеазы I и др.

Одним из самых ответственных этапов дизайна эксперимента является подбор целевых участков для редактирования ДНК и, соответственно, sgРНК.

В случае нуклеазы Cas9 S. pyogenes целевой участок должен иметь длину 20 н.п. и находиться с 5’-стороны от PAM-мотива с последовательностью 5’-NGG-3’. В среднем такие мотивы в геноме человека встречаются каждые 8 н.п., а их общее число в сборке GRCh38 достигает 303 795 341. То есть теоретически для редактируемой области генома можно подобрать даже несколько sgРНК.

Однако следует учитывать, что выбранный 20-нуклеотидный фрагмент вместе с PAM может встречаться в нескольких местах генома. Также белок Cas может быть толерантным по отношению к мисматчам при взаимодействии спейсера в составе sgРНК и целевого участка ДНК (в особенности к тем, которые находятся далеко от PAM). Более того, в некоторых случаях белок Cas может узнавать неканонический мотив PAM.

Эти факторы увеличивают вероятность нецелевого (off-target) редактирования генома, которые обязательно нужно учитывать на этом этапе дизайна. Также необходимо помнить о том, что геном данного конкретного объекта может отличаться от последовательности, выложенной в GenBank. Яркий пример – постоянные клеточные линии человека и сборка GRCh38.

В настоящее время разработано большое количество онлайн-инструментов, помогающих подбирать sgРНК для разных белков Cas в разных геномах. Во всех из них реализованы алгоритмы просчёта вероятности нецелевого редактирования и определения наиболее удачного варианта sgРНК.

Инжиниринг антител в клетках млекопитающих

В 2019 году группа специалистов из Высшей технической школы в Цюрихе¹⁶ разработала методику стабильной интеграции кассет генов лёгких и тяжёлых цепей антител в геном с помощью CRISPR/Cas-редактирования. В результате удалось получить эффективную систему дисплея и секреции антител.

При этом исследователи использовали оригинальный подход к доставке в клетки донорной ДНК (для HDR репарации). Изначально они включали её в состав дцДНК плазмиды. Но после электропорации всех компонентов системы CRISPR в клетки гибридомы комплекс Cas9/sgРНК вырезал донорную ДНК из плазмиды. Свои последующие функции она выполняла уже в виде фрагмента дцДНК.

Самое примечательное, что в вырезании донорной ДНК принимали участие те же Cas9 и sgРНК, что и в интеграции генных кассет в геном. Это достигалось за счёт встраивания в состав плазмиды такого же целевого участка ДНК, что и в сайте интеграции.

Анализ редких генетических вариантов

В феврале 2020 года группа исследователей из Китая и Саудовской Аравии¹⁷ разработала метод мечения единичных молекул ДНК перед секвенированием следующего поколения для анализа генетических вариантов с частотой встречаемости до 4x10^-5. Эта стратегия получила название Individual DNA Molecule sequencing (IDMseq)

Секвенирование проводили на платформах Oxford Nanopore, PacBio, Illumina. Для анализа его данных авторы предложили специальный биоинформатический алгоритм - Variant Analysis with UMI for Long-read Technology (VAULT).

Систему редактирования CRISPR/Cas в данном случае использовали для моделирования редких генетических вариантов.

Выявление генов, участвующих в регенерации спинного мозга после повреждения

В апреле 2020 года Keatinge M. et al.¹⁸ проанализировали, как нарушение рамки считывания в 30 макрофаг-ассоциированных генах влияет на скорость регенерации спинного мозга данио-рерио после повреждения. Мутации в исследуемые гены вносили методом геномного редактирования CRISPR/Cas.

В качестве РНК, программирующей специфичность нуклеазы Cas9, исследователи использовали пару tracrРНК/crРНК. При этом они провели скрининг 350 различных crРНК и в дальнейшей работе использовали только те из них, которые приводили к самому эффективному редактированию генов.

Авторы считают, что такой подход к выбору crРНК может быть более продуктивным, чем скрупулезный подбор единичных вариантов в соответствии с сущестующими рекомендациями.

Исследование нецелевых эффектов редактирования генома в раковых клеточных линиях

В конце 2019 года научная группа из Великобритании¹⁹ провела исследование нецелевых мутаций при редактировании генома трёх раковых клеточных линий: COLO320, HCC2998 и SW1463. Для их детекции авторы разработали быстрый и недорогой метод анализа на основе FISH.

Оказалось, что нецелевые эффекты могут быть весьма значительны и включать в себя не только протяжённые делеции, но и хромосомные перестройки. При этом sgРНК и белки Cas9 доставляли в клетки как в форме экспрессионных плазмид, так и в виде рибонуклеопротеинового комплекса.

Авторы полагают, что практика оценки нецелевых эффектов должна стать обязательным условием для любой публикации о редактировании генома.

Детекция вируса SARS-CoV-2 методом DETECTR

В 2018 году исследователи из США обнаружили, что фермент Cas12a обладает неспецифической транс-нуклеазной активностью по отношению к оцДНК (nonspecific ssDNA trans-cleavage activity).²⁰ Это проявляется в том, что когда комплекс Cas12a/crРНК связывается с целевым участком ДНК, у нуклеазы Cas12a появляется способность неспецифически расщеплять любые молекулы оцДНК, присутствующие в системе.

На основе этого феномена авторы разработали метод детекции папилломавирусов HPV16 и HPV18 в анальных мазках людей, который получил название DETECTR (DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter). Спустя ровно два года другая научная группа из США предложила модифицированный вариант этой методики для детекции коронавируса SARS-CoV-2 в мазках из носоглотки людей.²¹

Протокол SARS-CoV-2 DETECTR состоит из трех основных этапов:

1. Изотермическая амплификация участков N- и E-генов вируса SARS-CoV-2 методом RT-LAMP,
2. Связывание продуктов RT-LAMP с комплексом Cas12a/sgРНК и неспецифическое расщепление добавленных в реакционную смесь оцДНК-зондов, меченых FAM и биотином с разных концов,
3. Анализ результатов предыдущего этапа с помощью иммунохроматографических тест-полосок Milenia HybriDetect 1 от компании TwistDx.

За 7 лет с момента публикации первых работ по геномному редактированию CRISPR/Cas количество статей в базе данных PubMed по запросу «genome editing» достигло почти 18 000. Несмотря на это, многие молекулярно-биологические лаборатории ещё не взяли на вооружение этот метод.

В данном обзоре мы познакомили вас с самыми основами геномного редактирования. Надеемся, эта информация и продукция New England Biolabs помогут вам начать освоение этой технологии.

Кроме того, мы сотрудничаем с ещё одним производителем реагентов для CRISPR/Cas редактирования – южнокорейской компанией ToolGen. В её каталоге вы найдёте не только готовые Cas-белки и наборы, но и услуги по дизайну и синтезу компонентов системы CRISPR/Cas.

1. Lino C.A. et al. Delivering CRISPR: a review of the challenges and approaches. Drug Deliv. 2018. doi: 10.1080/10717544.2018.1474964.
2. Gupta D. et al. CRISPR-Cas9 system: A new-fangled dawn in gene editing. Life Sci. 2019. 232: 116636. doi: 10.1016/j.lfs.2019.116636.
3. Makarova K.S. et al. Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants. Nat Rev Microbiol. 2020. 18: 67-83. doi: 10.1038/s41579-019-0299-x.
4. Jinek M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012. 337: 816-821. doi: 10.1126/science.1225829.
5. Cong L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013. 339: 819-823. doi: 10.1126/science.1231143.
6. Mali P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 2013. 339: 823-826. doi: 10.1126/science.1232033.
7. Cho S.W. et al. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat Biotechnol. 2013. 31: 230-232. doi: 10.1038/nbt.2507.
8. NEB® EXPRESSIONS. Issue I, 2014.
9. Pickar-Oliver A., Gersbach C.A. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019. 20: 490-507. doi: 10.1038/s41580-019-0131-5.
10. Davis L., Maizels N. Homology-directed repair of DNA nicks via pathways distinct from canonical double-strand break repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014. 111: E924-E932. doi: 10.1073/pnas.1400236111.
11. Thurtle-Schmidt D.M., Lo T.W. Molecular biology at the cutting edge: A review on CRISPR/CAS9 gene editing for undergraduates. Biochem Mol Biol Educ. 2018. 46:.195-205. doi: 10.1002/bmb.21108.
12. Gaudelli N.M. et al. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 2017. 551: 464-471. doi: 10.1038/nature24644.
13. Deng W. et al. CASFISH: CRISPR/Cas9-mediated in situ labeling of genomic loci in fixed cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015. 112: 11870-11875. doi: 10.1073/pnas.1515692112.
14. Allen F. et al. Predicting the mutations generated by repair of Cas9-induced double-strand breaks. Nat Biotechnol. 2018. doi: 10.1038/nbt.4317.
15. Thomas M. et al. Best practice for CRISPR design using current tools and resources. Methods. 2019. 164-165: 3-17. doi: 10.1016/j.ymeth.2019.05.019.
16. Parola C. et al. Antibody discovery and engineering by enhanced CRISPR-Cas9 integration of variable gene cassette libraries in mammalian cells. MAbs. 2019. 11: 1367-1380. doi: 10.1080/19420862.2019.1662691.
17. Ссылка
18. Ссылка
19. Rayner E. et al. CRISPR-Cas9 Causes Chromosomal Instability and Rearrangements in Cancer Cell Lines, Detectable by Cytogenetic Methods. CRISPR J. 2019. 2: 406-416. doi: 10.1089/crispr.2019.0006.
20. Chen J.S. et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018. 360: 436-439. doi: 10.1126/science.aar6245.
21. Broughton J.P. et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 2020. doi: 10.1038/s41587-020-0513-4.