Реактивы, оборудование и
расходные материалы
для лабораторий
English version
пн-пт: 9:30-18:00 по МСК
0

#29 Редактирование геномов

01.04.2021

Редактирование генома – это намеренное внесение конкретных изменений в последовательность ДНК живых клеток или организма. В более широком смысле под этим термином понимают любые направленные манипуляции с геномами живых объектов.

Разработка эффективных и надёжных методов такого редактирования – давняя цель специалистов в области биологии и медицины. С одной стороны, это существенно обогатило бы инструментарий для фундаментального исследования геномов, с другой – открыло бы новые возможности по следующим направлениям:

  • Функциональный скрининг генов,
  • Изучение механизмов генетических заболеваний,
  • Разработка методов генной терапии,
  • Поиск мишеней для лечения заболеваний,
  • Получение мутантных модельных объектов для исследований заболеваний человека,
  • Получение линий растений и животных, способных синтезировать белки человека или обладающих новыми ценными свойствами и признаками,
  • Создание клеточных моделей для поиска и доклинического исследования новых лекарственных средств.
CRISPR/Cas системы прокариот

CRISPR (от англ. «Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats») – это локусы повторяющихся коротких повторов (18-50 н.п.), разделённых уникальными спейсерными последовательностями (17-84 н.п.), встречающиеся в геномах бактерий и архей.

В непосредственной близости от локусов CRISPR располагаются гены так называемых Cas-белков (от англ. «CRISPR-assosiated») и последовательность, кодирующая tracrРНК (trans-activating CRISPR РНК).

Установлено, что основная функция CRISPR/Cas систем в организмах прокариот – адаптивный иммунный ответ на вторжение ДНК плазмид и бактериофагов.

Последовательность уникальных спейсеров в локусах CRISPR (разноцветные шестиугольники на Рис.1) совпадают с фрагментами чужеродной ДНК, с которой клетка (или её предшественники) когда-либо сталкивалась.

Рис. 1. Схема адаптивного иммунного ответа на примере системы CRISPR-Cas9.JPG
Рис. 1. Схема адаптивного иммунного ответа на примере системы CRISPR/Cas9.
1

Иммунный ответ запускается в тот момент, когда в бактерию или архею проникает ДНК фага или плазмиды. В случае CRISPR/Cas9 системы (Рис. 1) происходят следующие события:

  1. Транскрипция локуса CRISPR с образованием pre-crРНК (pre-CRISPR РНК).
  2. Транскрипция гена Cas9 и синтез соответствующего белка.
  3. Транскрипция участка, кодирующего tracrРНК.
  4. tracrРНК взаимодействует с повторами в pre-crРНК за счёт частичной комплементарности.
  5. Белки Cas9 стабилизируют образовавшиеся двухцепочечные РНК-структуры, а РНКаза III их расщепляет. При этом pre-crРНК превращается несколько crРНК, которые гибридизованы с tracrРНК. И на своем 5’-конце crРНК несут последовательности спейсеров длиной 20 н.п. из CRISPR-локуса.
  6. Гибриды tracrРНК/crРНК направляют белки Cas9 к чужеродной ДНК.
  7. Нуклеаза Cas9 связывается с так называемым PAM-мотивом (от англ. «protospacer adjacent motif»), являющимся для нее сайтом узнавания в дцДНК.
  8. После связывания Cas9 расплетает цепи ДНК в направлении 3’-5’ от PAM-мотива. И если оказывается, что минус цепь комплементарна спейсерной последовательности на 5’-конце crРНК, то нуклеаза вносит в ДНК двухцепочечный разрыв на расстоянии 3 н.п. от мотива PAM.

Если же клетка никогда не сталкивалась с данным бактериофагом или плазмидой, то подобного расщепления не происходит. Но при этом другие белки Cas встраивают фрагменты чужеродной ДНК в локусы CRISPR2. И при повторной встрече с патогеном, активируется иммунный ответ

Принцип технологии редактирования генома CRISPR/Cas

Уникальная способность гибридов tracrРНК/crРНК программировать работу нуклеаз Cas9 не могла остаться незамеченной специалистами, занимающимися разработкой методов геномного редактирования.

Ведь по сути, одним и тем же ферментом Cas9 можно направленно расщепить совершенно разные участки ДНК с PAM-мотивом. Для этого достаточно, чтобы последовательность спейсера в составе tracrРНК/crРНК совпадал с целевой последовательностью ДНК.

Более того, оказалось, что такая система будет работать, даже если искусственным путём объединить tracrРНК и crРНК в единую укороченную РНК-химеру, получившую название гидовой РНК (sgРНК - от англ. «single guide РНК»)4.

В 2012-2013 гг. были опубликованы первые работы, авторам которых удалось осуществить сайт-специфическое расщепление ДНК в клетках эукариот с помощью компонентов CRISPR/Cas9 системы.

Что же происходит после того, как нуклеаза Cas9 вносит двухцепочечный разрыв в геном живой клетки?

Рис. 2. Варианты репарационных механизмов, активирующихся после двухцепочечного разрыва ДНК..JPG
Рис. 2. Варианты репарационных механизмов, активирующихся после двухцепочечного разрыва ДНК.
8

Основной механизм репарации такого разрыва - негомологичное соединение концов (NHEJ). Он очень неточен и в подавляющем числе случаев сопровождается образованием инсерций и/или делеций в месте стыковки. Репарация NHEJ внутри экзона может привести к сдвигу рамки считывания, образованию преждевременного стоп-кодона и, в конечном итоге, к нокауту гена (Рис. 3)

Если же у клетки есть образец для восстановления последовательности (например, сестринская хроматида в поздней S- и G2-фазах клеточного цикла), то репарация пойдет также по пути гомологичной рекомбинации (HDR)

Кроме того, можно предоставить клетке и свой образец ДНК (донорную ДНК). Его концы должны быть гомологичны свободным концам ДНК, образовавшимся в результате разрыва. Таким образом можно заменить отдельные нуклеотиды в целевой последовательности или внести необходимую инсерцию (Рис. 3)

Рис. 3. Возможные результаты геномного редактирования с помощью сайт-специфических нуклеаз..JPG
Рис. 3. Возможные результаты геномного редактирования с помощью сайт-специфических нуклеаз.
1

Даже в присутствии донорной ДНК эффективность репарации по механизму HDR значительно уступает эффективности репарации NHEJ. Чтобы увеличить вероятность гомологичной рекомбинации, специалисты тестируют разные подходы, например, ингибирование пути NHEJ, синхронизация клеточных линий в одинаковой фазе клеточного цикла, использование клеточных линий, дефицитных по компонентам NHEJ.1

Преимущества технологии CRISPR/Cas

Две основные альтернативные технологии редактирования генома - ZFN и TALEN - заключаются в использовании химерных нуклеаз, состоящих из ДНК-связывающих и ДНКазных доменов.

В случае нуклеаз ZFN (от англ. «zink-finger nucleases») в качестве ДНК-связывающих доменов используют цинковые пальцы, каждый из которых способен узнать последовательность из трех нуклеотидов. В роли ДНКазного домена выступает каталитический домен рестриктазы FokI.

Поскольку фермент FokI функционирует только в виде димера, то для редактирования конкретного участка генома необходимо создать две нуклеазы ZFN (Рис. 4).

Распознавание тринуклеотидов цинковыми пальцами нельзя назвать строгим. Поэтому частота расщепления ДНК в нецелевых участках относительно высока.

Рис. 4. Устройство нуклеаз ZFN..JPG
Рис. 4. Устройство нуклеаз ZFN.
1

В случае нуклеаз TALEN (от англ. «Transcription Activator-like Effector Nucleases») также используется каталитический домен рестриктазы FokI. За связывание же с целевым участком ДНК отвечают домены на основе белков TALE (от англ. «Transcription Activator-like Effectors»), каждый из которых узнает один нуклеотид. Такая система более специфична, по сравнению с ZFN.

Рис. 5. Устройство нуклеаз TALEN..JPG
Рис. 5. Устройство нуклеаз TALEN.
1

Для создания нуклеаз ZFN и TALEN исследователь должен владеть широким спектром методов генной инженерии и иметь немалый практический опыт. К тому же, каждый новый проект по редактированию требует разработки, как минимум, двух новых ферментов

В случае же CRISPR/Cas систем для изменения специфичности нуклеазы достаточно всего лишь синтезировать другую гидовую РНК. Сравнение технологий по другим характеристикам см. в Табл. 1.

Таблица 1. Сравнение харатеристик технологий ZFN, TALEN и CRISPR/Cas.2

Характеристика ZFN TALEN CRISPR/Cas9
Компонент,
ответственный за
распознавание
целевого участка
ДНК
Белковый
домен
Белковый
домен
Гидовая РНК
Компонент,
требующий
дизайна
Белок Белок Гидовая РНК
Специфичность и
эффективность
Низкие Средние Высокие
Нецелевой
мутагенез
Переменная
частота
Низкая
частота
Средняя
частота
Стоимость Очень
дорого
Дорого Дёшево

Белки Cas, используемые в протоколах редактирования геномов

В настоящее время исследователи используют для редактирования геномов не только нативные нуклеазы Cas9 различных видов прокариот, но и их модифицированные варианты (Табл. 2). Также всё большую популярность приобретают белки Cas12a, а также белки Cas13, которые при участии sgРНК способны связываться и расщеплять молекулы РНК.

Таблица 2. Примеры белков Cas9, используемых в протоколах CRISPR/Cas.9

Название Описание PAM (5’→3’) Особые характеристики
SpCas9 Нативный Cas9 Streptococcus pyogenes NGG 1 368 а.о.
VRER SpCas9 D1135V, G1218R , R1335E, T1337R NGCG Альтернативный PAM
VQR SpCas9 D1135V, R1335Q, T1337R NGAN или NGNG Альтернативный PAM
EQR SpCas9 D1135E, R1335Q, T1337R NGAG Альтернативный PAM
xCas9-3.7 A262T, R324L, S409I, E480K , E543D, M694I, E1219V Альтернативный PAM
eSpCas9 K810A , K1003A , R1060A NGG Повышенная специфичность
Cas9-HF1 N497A , R661A , Q695A , Q926A NGG Повышенная специфичность
HypaCas9 N692A , M694A , Q695A , H698A NGG Повышенная специфичность
evoCas9 M495V, Y515N, K526E, R661Q NGG Повышенная специфичность
HiFi Cas9 R691A NGG Повышенная специфичность
ScCas9 Нативный Cas9 Streptococcus canis NNG 1 375 а.о.
StCas9 Нативный Cas9 Streptococcus thermophilus NNAGAAW 1 121 а.о.
NmCas9 Нативный Cas9 Neisseria meningitidis NNNNGATT 1 082 а.о.
SaCas9 Нативный Cas9 Staphylococcus aureus NNGRRT 1 053 а.о.
CjCas9 Нативный Cas9 Campylobacter jejuni NNNVRYM 984 а.о.
CasX Deltaproteobacteria и Planctomycetes TTCN 980 а.о.
SpRY Мутантная форма SpCas9 (near-PAMless) NRN>NYN -

Отдельно стоит выделить две мутантные формы белка Cas9 Streptococcus pyogenes – nCas9 и dCas9.

В состав нативного SpCas9 входят два нуклеазных домена – HNH и RuvC. Каждый из них расщепляет только одну строго определённую цепь ДНК.

Если один из доменов инактивирован, то фермент превратится в никазу (nCas9). Обычно этого добиваются, внося мутацию D10A в домен HNH или мутацию H840A в домене RuvC.

Для редактирования генома в таком случае приходится подбирать два рядом лежащих целевых ДНК-участка и, соответственно, две sgРНК (Рис.6).

В результате одновременной обработки двумя никазами в ДНК появляются два ника. В отсутствии донорной ДНК они восстанавливаются по механизму репарации однонитевых разрывов (SSBR). Но если клетке предоставить образец, то дополнительно запустится механизм гомологичной рекомбинации HDR.10

При использовании никаз количество нуклеотидов, которые должны распознать рибонуклеопротеиновые комплексы, в два раза больше, чем при стандартной схеме. Таким образом удаётся существенно увеличить специфичность CRISPR/Cas системы и снизить частоту нецелевых событий редактирования.

Рис. 6. Принцип редактирования генома с помощью никаз nCas9..JPG
Рис. 6. Принцип редактирования генома с помощью никаз nCas9.
8

Белки Cas производства New England Biolabs

Нуклеаза Cas9, S. pyogenes - нативная РНК-зависимая ДНК-эндонуклеаза Cas9 Streptococcus pyogenes. Катализирует сайт-специфическое расщепление дцДНК за 3 нуклеотида до PAM-мотива (5’-NGG-3’). При этом PAM-мотив должен следовать за целевым участком ДНК, а 5’-конец гидовой РНК должен быть комплементарен минус-цепи целевого участка. Идеально подходит для расщепления дцДНК in vitro.

Нуклеаза EnGen® Spy Cas9 NLS  - модифицированная форма нуклеазы Cas9 S. pyogenes. Содержит на N- и С-концах сигналы ядерной локализации (NLS) T-антигена вируса SV40, облегчающие проникновение комплексов Cas9/sgРНК в ядра клеток. Идеально подходит для расщепления дцДНК in vitro.

Нуклеаза EnGen® Sau Cas9 - нативная РНК-зависимая ДНК-эндонуклеаза Staphylococcus aureus. Катализирует сайт-специфическое расщепление дцДНК за 3 нуклеотида до PAM-мотива (5’-NNGRRT-3’). При этом PAM-мотив должен следовать за целевым участком ДНК, а 5’-конец гидовой РНК должен быть комплементарен минус-цепи целевого участка.

Никаза EnGen® Spy Cas9 - модифицированная форма нуклеазы EnGen® Spy Cas9 NLS с точечной мутацией (D10A) в нуклеазном домене RuvC и сигналами ядерной локализации (NLS) T-антигена вируса SV40 на N- и C-концах. Фермент способен только никировать дцДНК. Для редактирования генома требуется подбор двух целевых участков и двух sgРНК.

EnGen® Spy dCas9 (SNAP-tag®) - модифицированная форма нуклеазы EnGen® Spy Cas9 NLS с инактивированными нуклеазными доменами. При этом белок сохраняет РНК-зависимую ДНК-связывающую активность. На N-конце EnGen® Spy dCas9 (SNAP-tag®) присутствует метка SNAP-tag®, с которой могут ковалентно взаимодействовать флуорофоры, биотин и ряд других субстратов.

Нуклеаза EnGen® Lba Cas12a (Cpf1) - РНК-зависимая ДНК-эндонуклеаза Cas12a Lachnospiraceae bacterium. Катализирует сайт-специфическое расщепление дцДНК через ~18 нуклеотидов после PAM-мотива (5’-TTTN-3’). При этом целевой участок ДНК должен следовать за PAM-мотивом, а 3’-конец гидовой РНК должен быть комплементарен минус-цепи целевого участка. Продукты расщепления нуклеазой EnGen® Lba Cas12a (Cpf1) имеют 5’-липкие концы.

Фермент направляется более короткой, чем в случае Cas9, гидовой РНК (40-44 н.). На N- и С-концах он содержит сигналы ядерной локализации (NLS), облегчающие проникновение комплексов Cas12a/sgРНК в ядра клеток.

Нуклеаза активна в диапазоне температур от 16°C до 48°C и подходит для редактирования геномов холоднокровных организмов, например Danio rerio и Xenopus.

Формы доставки компонентов CRISPR/Cas в живые клетки

Задача по доставке компонентов CRISPR/Cas в исследуемый объект состоит из двух частей. Во-первых, надо определить, в какой форме лучше всего доставлять нуклеазу Cas, sgРНК и, в случае необходимости, донорную ДНК. А во-вторых – каким способом.

Что касается формы, то sgРНК можно доставлять в готовом виде, либо в составе экспрессионного ДНК-вектора под промотором, узнаваемым РНК полимеразой III (например, U6).

Нуклеазы Cas доставляют в живые клетки либо в виде белков, либо в виде мРНК, либо опять же в составе экспрессионного ДНК-вектора. В последнем случае кодоны в последовательности гена Cas должны быть оптимизированы в соответствии с предпочтениями исследуемого объекта.

Если сравнивать преимущества и недостатки различных форм доставки компонентов CRISPR/Cas, то самым предпочтительным вариантом оказывается использование готового белка Cas и синтезированной sgРНК (Табл. 3). Причем в живые клетки их вводят не по отдельности, а в виде заранее подготовленных рибонуклеопротеиновых комплексов Cas/sgРНК.

Таблица 3. Сравнение форм доставки компонентов CRISPR/Cas в живые системы.

Формы доставки Форма доставки.jpg Форма доставки.jpg Форма доставки.jpg
Эффективность редактирования Низкая и вариабельная Низкая и вариабельная Высокая и повторяющаяся
Специфичность редактирования Низкая Высокая Высокая
Скорость подготовки Низкая Средняя Высокая
Скорость получения результата Низкая Средняя Высокая
Нежелательное встраивание в геном Возможно Невозможно Возможно
Стоимость Очень низкая Средняя Низкая

Донорную ДНК можно доставлять в виде одноцепочечного ДНК-олигонуклеотида или в составе плазмиды.

Решения New England Biolabs для подготовки различных форм компонентов системы CRISPR/Cas

В следующей таблице перечислены различные продукты New England Biolabs, которые могут быть полезны на разных этапах подготовки компонентов системы CRISPR/Cas.

Название Возможное применение
ДНК-полимеразы высокой точности и
готовые смеси с ними
Сборка экспрессионных
векторов и плазмид с
донорной ДНК
Эндонуклеазы рестрикции
Лигазы и лигазные смеси
Киназы
Фосфатазы и смеси для дефосфорилирования
Компетентные клетки E.coli
Набор NEB® для клонирования продуктов ПЦР
Набор Gibson Assembly® для сборки и клонирования
ДНК-конструкций
Набор NEBuilder® HiFi для сборки и клонирования
ДНК-конструкций
Набор NEB® для сборки и клонирования
ДНК-конструкций методом Golden Gate
Набор Q5® для сайт-направленного мутагенеза Сайт-направленный
мутагенез имеющихся
векторов
Набор Q5® для сайт-направленного мутагенеза без
компетентных клеток
Набор HiScribe™ T7 для высокоэффективного
синтеза РНК
Синтез sgРНК и мРНК
методом транскрипции
in vitro
Набор HiScribe™ T7 для быстрого
высокоэффективного синтеза РНК
Набор HiScribe™ T7 для синтеза РНК с кэпированием
ARCA и аденилированием 3'-конца
Набор Monarch® для очистки РНК-продуктов
ферментативных реакций, 10 мкг
Очистка РНК после
синтеза
Набор Monarch® для очистки РНК-продуктов
ферментативных реакций, 50 мкг
Набор Monarch® для очистки РНК-продуктов
ферментативных реакций, 500 мкг
Набор EnGen® для синтеза sgРНК, S. pyogenes Синтез sgРНК для белков
Cas9 New England Biolabs

О последнем продукте стоит рассказать немного подробнее, поскольку он существенно упрощает самостоятельный синтез sgРНК и оптимизирован для работы с белками Cas9 производства New England Biolabs.

Набор EnGen® для синтеза sgРНК, S. pyogenes

Данный набор предназначен для простого и быстрого синтеза 4-25 мкг гидовой РНК (sgРНК) с помощью входящих в комплект реагентов и таргет-специфичного ДНК-олигонуклеотида, подобранного пользователем. Получаемая таким образом sgРНК может управлять активностью следующих вариантов нуклеазы Cas9:

  • Нуклеаза Cas9, S. pyogenes,
  • Нуклеаза EnGen® Spy Cas9 NLS,
  • Никаза EnGen® Spy Cas9,
  • Белок EnGen® Spy dCas9 (SNAP-tag®).

Процесс синтеза sgРНК с помощью набора EnGen® состоит из следующих этапов:

  1. Выбор целевого участка ДНК для редактирования,
  2. Дизайн и заказ синтеза таргет-специфичного одноцепочечного
  3. ДНК-олигонуклеотида длиной ~55 нуклеотидов,
  4. Проведение самой реакции синтеза sgРНК с помощью набора EnGen®,
  5. Обработка продуктов реакции ДНКазой I,
  6. Очистка sgРНК и оценка выхода продукта.

Рис. 7. Синтез сгРНК с помощью набора EnGen®..JPG
Рис.7. Синтез сгРНК с помощью набора EnGen®.

Для подбора таргет-специфичного олигонуклеотида компания New England Biolabs разработала с пециальный онлайн-инструмент EnGen™ sgRNA Template Oligo Designer. Его 5’-конец должен содержать промотор фага T7, средняя часть - соответствовать целевой последовательности редактируемой ДНК, а 3’-конец - быть комплементарным 5’-концу скаффолд-олигонуклеотида, входящего в состав набора.

На первом этапе синтеза таргет-специфичный ДНК олигонуклеотид и скаффолд-олигонуклеотид отжигаются друг на друге. Затем происходит достройка вторых цепей этой конструкции с помощью ДНК-полимеразы. В результате последующей in vitro транскрипции и образуется sgРНК (Рис. 7).

Способы доставки компонентов CRISPR/Cas в живые системы

Их разделяют на 3 основные группы:

  • Физические способы: микроинъекции, электропорация, нуклеофекция, гидродинамические инъекции, биобаллистика.
  • Химические методы: липосомы (трансфекция), пептиды, наноклубки, наночастицы золота и др.
  • Доставка с помощью вирусных частиц на основе лентивирусов, герпесвирусов, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов.

Более подробно указанные способы доставки освещаются в публикации Lino C.A. et al.1

Если говорить о растительных объектах, то стоит упомянуть такие методы, как трансформация с помощью агробактерий и Ti-плазмид, доставка с помощью вирусных систем (например, на основе геминивирусов), биобаллистика.

Методы анализа результатов редактирования геномов

Оценивать результаты редактирования генома можно на трёх уровнях: ДНК, мРНК и белков.

Выбор метода анализа ДНК зависит от того, какие мутации вы хотели внести редактированием (см. Табл. 5).

Рестриктный анализ возможен в случае, если в целевом участке ДНК должен был появиться или, наоборот, исчезнуть сайт узнавания какой-либо рестриктазы.

Если в результате редактирования целевой участок должен был претерпеть достаточно длинные инсерции или делеции, то можно воспользоваться методом ПЦР и сравнить количества ампликонов разной длины.

Также для детекции инсерций и делеций, а также точечных мутаций подходит метод реал-тайм ПЦР с ДНК-зондами.

Секвенирование даст прямой ответ на вопрос, какие конкретно изменения произошли в целевом участке ДНК.

Таблица 5. Продукция New England Biolabs для анализа результатов редактирования геномов.

Название Метод анализа
Эндонуклеазы рестрикции Рестриктный анализ
ДНК-полимеразы, готовые смеси для ПЦР, наборы для ПЦР, маркеры длин ДНК, красители для нанесения на гель ПЦР
Универсальная готовая смесь Luna® для ПЦР в реальном времени ПЦР в реальном времени
Универсальная готовая смесь Luna® для ПЦР в реальном времени с ДНК-зондами
Универсальный набор Luna® для одноэтапной ОТ-ПЦР в реальном времени ОТ-ПЦР в реальном времени (для анализа на уровне мРНК)
Универсальный набор Luna® для одноэтапной ОТ-ПЦР в реальном времени с ДНК-зондами
Универсальный набор Luna® для одноэтапной ОТ-ПЦР в реальном времени с ДНК-зондами без ROX
Линейка NEBNext реагентов для пробоподготовки к NGS на платформах Illumina®, Ion Torrent™, Oxford Nanopore Technologies® Секвенирование
T7 эндонуклеаза I Детекция мутаций с помощью T7 эндонуклеазы I
Набор EnGen® для детекции мутаций
Маркер молекулярной массы белков широкого спектра (10-200 кДа), неокрашенный Электрофорез белков в SDS-ПААГ (для анализа на уровне белков)
Маркер молекулярной массы белков широкого спектра (11-250 кДа), предокрашенный синий
Маркер молекулярной массы белков широкого спектра (10-250 кДа), предокрашенный разноцветный

Еще один метод детекции мутаций после редактирования генома основан на использовании T7 эндонуклеазы I. И компания New England Biolabs предлагает специальный набор для такого анализа: набор EnGen® для детекции мутаций.

Принцип детекции мутаций заключается в способности T7 эндонуклеазы I распознавать и расщеплять в двухцепочечной ДНК участки неспаренных оснований длиной более 1 н.п.

Протокол анализа состоит из следующих этапов:

  1. Высокоточная амплификация с помощью ПЦР участков геномной ДНК, подвергшихся редактированию. В качестве ДНК-полимеразы в данном наборе используется Q5® Hot Start HF ДНК-полимераза, являющаяся на сегодняшний день самым точным ферментом такого типа.
  2. Денатурация и повторный отжиг друг на друге продуктов ПЦР. Поскольку в ходе редактирования участка генома в нём появляются инсерции и делеции, то на этом этапе протокола образуются гетеродуплексы, часть оснований которых не спарена.
  3. Продукты предыдущей реакции обрабатываются T7 эндонуклеазой I. В результате фрагменты с полностью комплементарными друг другу цепями остаются интактными, а гетеродуплексы расщепляются с образованием более коротких продуктов.
  4. Анализ продуктов расщепления T7 эндонуклеазой I c помощью гель-электрофореза или другими методами.

Рис. 8. Принцип детекции мутаций с помощью набора EnGen®..JPG
Рис. 8. Принцип детекции мутаций с помощью набора EnGen®.

Дизайн эксперимента по геномному редактированию CRISPR/Cas

Любой эксперимент по геномному редактированию состоит из следующих этапов: дизайн, подготовка компонентов CRISPR/Cas9, доставка компонентов CRISPR/Cas9, анализ результатов.

В предыдущих разделах мы уже рассмотрели основные варианты реализации этапов 2 - 4. Теперь, опираясь на эту информацию, мы можем резюмировать, что для успешного проведения эксперимента в ходе дизайна необходимо:

  1. Сформулировать цель исследования: ответы на какие вопросы вы хотите получить в результате эксперимента?
  2. Выбрать объект исследования: животные или растительные объекты, культуры клеток или модельный организм?
  3. Определить, какие конкретно области генома вы будете редактировать: гены, промоторы, регуляторные элементы, некодирующие участки?
  4. Выбрать тип редактирования: нокаут гена, нокин гена, точечные мутации, делеции, инсерции, никирование, редактирование оснований, активация/репрессия генов, эпигенетические модификации, мечение?
  5. Определить, какие Cas белки подойдут для вашей цели: нативные Cas9, Cas12a, Cas13 или их мутантные формы?
  6. Подобрать in silico целевые участки ДНК для редактирования и sgРНК.
  7. Выбрать, в какой форме вы будете доставлять компоненты CRISPR/Cas в исследуемый объект: рибонуклеопротеиновый комплекс Cas + sgРНК, мРНК Cas + sgРНК, экспрессионные плазмиды с генами Cas и sgРНК.
  8. Определиться с методом подготовки компонентов CRISPR/Cas и способом их доставки в исследуемый объект: физические способы, химические способы, вирусные частицы.
  9. Подобрать подходящие контроли, прежде всего для системы доставки компонентов CRISPR/Cas.
  10. Определиться с методами анализа результатов эксперимента: ПЦР/реал-тайм ПЦР, секвенирование, детекция мутаций с помощью T7 эндонуклеазы I и др.

Одним из самых ответственных этапов дизайна эксперимента является подбор целевых участков для редактирования ДНК и, соответственно, sgРНК.

В случае нуклеазы Cas9 S. pyogenes целевой участок должен иметь длину 20 н.п. и находиться с 5’-стороны от PAM-мотива с последовательностью 5’-NGG-3’. В среднем такие мотивы в геноме человека встречаются каждые 8 н.п., а их общее число в сборке GRCh38 достигает 303 795 341. То есть теоретически для редактируемой области генома можно подобрать даже несколько sgРНК.

Однако следует учитывать, что выбранный 20-нуклеотидный фрагмент вместе с PAM может встречаться в нескольких местах генома. Также белок Cas может быть толерантным по отношению к мисматчам при взаимодействии спейсера в составе sgРНК и целевого участка ДНК (в особенности к тем, которые находятся далеко от PAM). Более того, в некоторых случаях белок Cas может узнавать неканонический мотив PAM.

Эти факторы увеличивают вероятность нецелевого (off-target) редактирования генома, которые обязательно нужно учитывать на этом этапе дизайна. Также необходимо помнить о том, что геном данного конкретного объекта может отличаться от последовательности, выложенной в GenBank. Яркий пример – постоянные клеточные линии человека и сборка GRCh38.

В настоящее время разработано большое количество онлайн-инструментов, помогающих подбирать sgРНК для разных белков Cas в разных геномах. Во всех из них реализованы алгоритмы просчёта вероятности нецелевого редактирования и определения наиболее удачного варианта sgРНК.

Примеры использования продукции New England Biolabs для CRISPR/Cas

Инжиниринг антител в клетках млекопитающих

В 2019 году группа специалистов из Высшей технической школы в Цюрихе16 разработала методику стабильной интеграции кассет генов лёгких и тяжёлых цепей антител в геном с помощью CRISPR/Cas-редактирования. В результате удалось получить эффективную систему дисплея и секреции антител.

При этом исследователи использовали оригинальный подход к доставке в клетки донорной ДНК (для HDR репарации). Изначально они включали её в состав дцДНК плазмиды. Но после электропорации всех компонентов системы CRISPR в клетки гибридомы комплекс Cas9/sgРНК вырезал донорную ДНК из плазмиды. Свои последующие функции она выполняла уже в виде фрагмента дцДНК.

Самое примечательное, что в вырезании донорной ДНК принимали участие те же Cas9 и sgРНК, что и в интеграции генных кассет в геном. Это достигалось за счёт встраивания в состав плазмиды такого же целевого участка ДНК, что и в сайте интеграции.

Анализ редких генетических вариантов

В феврале 2020 года группа исследователей из Китая и Саудовской Аравии17 разработала метод мечения единичных молекул ДНК перед секвенированием следующего поколения для анализа генетических вариантов с частотой встречаемости до 4x10-5. Эта стратегия получила название Individual DNA Molecule sequencing (IDMseq)

Секвенирование проводили на платформах Oxford Nanopore, PacBio, Illumina. Для анализа его данных авторы предложили специальный биоинформатический алгоритм - Variant Analysis with UMI for Long-read Technology (VAULT).

Систему редактирования CRISPR/Cas в данном случае использовали для моделирования редких генетических вариантов.

Выявление генов, участвующих в регенерации спинного мозга после повреждения

В апреле 2020 года Keatinge M. et al.18 проанализировали, как нарушение рамки считывания в 30 макрофаг-ассоциированных генах влияет на скорость регенерации спинного мозга данио-рерио после повреждения. Мутации в исследуемые гены вносили методом геномного редактирования CRISPR/Cas.

В качестве РНК, программирующей специфичность нуклеазы Cas9, исследователи использовали пару tracrРНК/crРНК. При этом они провели скрининг 350 различных crРНК и в дальнейшей работе использовали только те из них, которые приводили к самому эффективному редактированию генов.

Авторы считают, что такой подход к выбору crРНК может быть более продуктивным, чем скрупулезный подбор единичных вариантов в соответствии с сущестующими рекомендациями.

Исследование нецелевых эффектов редактирования генома в раковых клеточных линиях

В конце 2019 года научная группа из Великобритании19 провела исследование нецелевых мутаций при редактировании генома трёх раковых клеточных линий: COLO320, HCC2998 и SW1463. Для их детекции авторы разработали быстрый и недорогой метод анализа на основе FISH.

Оказалось, что нецелевые эффекты могут быть весьма значительны и включать в себя не только протяжённые делеции, но и хромосомные перестройки. При этом sgРНК и белки Cas9 доставляли в клетки как в форме экспрессионных плазмид, так и в виде рибонуклеопротеинового комплекса.

Авторы полагают, что практика оценки нецелевых эффектов должна стать обязательным условием для любой публикации о редактировании генома.

Детекция вируса SARS-CoV-2 методом DETECTR

В 2018 году исследователи из США обнаружили, что фермент Cas12a обладает неспецифической транс-нуклеазной активностью по отношению к оцДНК (nonspecific ssDNA trans-cleavage activity).20 Это проявляется в том, что когда комплекс Cas12a/crРНК связывается с целевым участком ДНК, у нуклеазы Cas12a появляется способность неспецифически расщеплять любые молекулы оцДНК, присутствующие в системе.

На основе этого феномена авторы разработали метод детекции папилломавирусов HPV16 и HPV18 в анальных мазках людей, который получил название DETECTR (DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter). Спустя ровно два года другая научная группа из США предложила модифицированный вариант этой методики для детекции коронавируса SARS-CoV-2 в мазках из носоглотки людей.21

Протокол SARS-CoV-2 DETECTR состоит из трех основных этапов:

  1. Изотермическая амплификация участков N- и E-генов вируса SARS-CoV-2 методом RT-LAMP,
  2. Связывание продуктов RT-LAMP с комплексом Cas12a/sgРНК и неспецифическое расщепление добавленных в реакционную смесь оцДНК-зондов, меченых FAM и биотином с разных концов,
  3. Анализ результатов предыдущего этапа с помощью иммунохроматографических тест-полосок Milenia HybriDetect 1 от компании TwistDx.

Заключение

За 7 лет с момента публикации первых работ по геномному редактированию CRISPR/Cas количество статей в базе данных PubMed по запросу «genome editing» достигло почти 18 000. Несмотря на это, многие молекулярно-биологические лаборатории ещё не взяли на вооружение этот метод.

В данном обзоре мы познакомили вас с самыми основами геномного редактирования. Надеемся, эта информация и продукция New England Biolabs помогут вам начать освоение этой технологии.

Кроме того, мы сотрудничаем с ещё одним производителем реагентов для CRISPR/Cas редактирования – южнокорейской компанией ToolGen. В её каталоге вы найдёте не только готовые Cas-белки и наборы, но и услуги по дизайну и синтезу компонентов системы CRISPR/Cas.

Список литературы

  1. Lino C.A. et al. Delivering CRISPR: a review of the challenges and approaches. Drug Deliv. 2018. doi: 10.1080/10717544.2018.1474964.
  2. Gupta D. et al. CRISPR-Cas9 system: A new-fangled dawn in gene editing. Life Sci. 2019. 232: 116636. doi: 10.1016/j.lfs.2019.116636.
  3. Makarova K.S. et al. Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants. Nat Rev Microbiol. 2020. 18: 67-83. doi: 10.1038/s41579-019-0299-x.
  4. Jinek M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012. 337: 816-821. doi: 10.1126/science.1225829.
  5. Cong L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013. 339: 819-823. doi: 10.1126/science.1231143.
  6. Mali P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 2013. 339: 823-826. doi: 10.1126/science.1232033.
  7. Cho S.W. et al. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat Biotechnol. 2013. 31: 230-232. doi: 10.1038/nbt.2507.
  8. NEB® EXPRESSIONS. Issue I, 2014.
  9. Pickar-Oliver A., Gersbach C.A. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019. 20: 490-507. doi: 10.1038/s41580-019-0131-5.
  10. Davis L., Maizels N. Homology-directed repair of DNA nicks via pathways distinct from canonical double-strand break repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014. 111: E924-E932. doi: 10.1073/pnas.1400236111.
  11. Thurtle-Schmidt D.M., Lo T.W. Molecular biology at the cutting edge: A review on CRISPR/CAS9 gene editing for undergraduates. Biochem Mol Biol Educ. 2018. 46:.195-205. doi: 10.1002/bmb.21108.
  12. Gaudelli N.M. et al. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 2017. 551: 464-471. doi: 10.1038/nature24644.
  13. Deng W. et al. CASFISH: CRISPR/Cas9-mediated in situ labeling of genomic loci in fixed cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015. 112: 11870-11875. doi: 10.1073/pnas.1515692112.
  14. Allen F. et al. Predicting the mutations generated by repair of Cas9-induced double-strand breaks. Nat Biotechnol. 2018. doi: 10.1038/nbt.4317.
  15. Thomas M. et al. Best practice for CRISPR design using current tools and resources. Methods. 2019. 164-165: 3-17. doi: 10.1016/j.ymeth.2019.05.019.
  16. Parola C. et al. Antibody discovery and engineering by enhanced CRISPR-Cas9 integration of variable gene cassette libraries in mammalian cells. MAbs. 2019. 11: 1367-1380. doi: 10.1080/19420862.2019.1662691.
  17. Ссылка
  18. Ссылка
  19. Rayner E. et al. CRISPR-Cas9 Causes Chromosomal Instability and Rearrangements in Cancer Cell Lines, Detectable by Cytogenetic Methods. CRISPR J. 2019. 2: 406-416. doi: 10.1089/crispr.2019.0006.
  20. Chen J.S. et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018. 360: 436-439. doi: 10.1126/science.aar6245.
  21. Broughton J.P. et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 2020. doi: 10.1038/s41587-020-0513-4.

© 2012-2021 SkyGen
Информация и цены на сайте не являются публичной офертой