Редактирование генома

CRISPR-Cas* системы - часть адаптивного иммунитета бактерий и архей. Эти организмы используют CRISPR-Cas для защиты от чужеродных нуклеиновых кислот, входящих в состав вирусов или плазмид, попадающих в клетку.

Обычно такая система состоит из двух основных компонентов – crРНК (CRISPR РНК) и белков Cas. В геноме бактерии или археи crРНК закодирована в виде набора элементов: уникальных последовательностей (спейсеров), фланкированных короткими повторами.

Спейсеры соответствуют чужеродным последовательностям нуклеотидов, с которыми раньше сталкивалась клетка. РНК, считанная со спейсера, формирует комплекс с белками-нуклеазами Cas, а затем комплементарно связывается с последовательностью-мишенью, что запускает деградацию мишени. Бактерии и археи могут включать в геном новые спейсеры после встречи с новым биологическим агентом.

Эндонуклеаза Cas9

В биотехнологии наиболее широко используются CRISPR-Cas системы II типа, считающиеся наиболее простыми. В такой системе работает только одна нуклеаза Cas (Cas9), которая помогает созреванию crРНК, участвует в поиске мишени и ее разрезании. Кроме crРНК, в процессе участвует tracrРНК. crРНК для каждого спейсера не считывается по отдельности, вместо этого транскрибируется сразу весь набор (CRISPR-кассета, pre-crРНК). tracrРНК, связанная с такой pre-crРНК образует двухцепочечную структуру, которая узнается и разрезается РНКазой III на отдельные маленькие crРНК, соответствующие одному спейсеру и окружающим его повторам. tracrРНК и отдельные crРНК составляют с Cas9 комплекс, который находит таргетную последовательность и вносит двухцепочечный разрез.

Такую систему можно легко собрать и доставить в выбранную клетку, объединив в векторе последовательности гена эндонуклеазы Cas9 и кассеты CRISPR. Для более удобного практического применения tracrРНК и crРНК соединяют и объединяют в одну sgРНК (single-guide RNA), а вместо РНКазы III в клетках эукариот работают других рибонуклеазы.

Большой популярностью пользуется эндонуклеаза Cas9, изначально выделенная из бактерии Streptococcus pyogenes. Ее применяли для редактирования генома множества живых организмов: от бактерий и дрожжей до обезьян и человека. Эту эндонуклеазу можно выбрать в каталоге на сайте [https://www.skygen.com/katalog/reagenty_i_rashodnye_materialy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_modi....

Кроме классической версии фермента, можно также найти его модификации. Например, Cas9 с сигналом ядерной локализации, облегчающим проникновение в ядро клетки или инактивированный белок dCas9. Фермент dCas9 лишен своей эндонуклеазной функции и способен только связываться с таргетной последовательностью. На N-конец dCas9 дополнительно помещен SNAP-tag, с которым могут взаимодействовать флуорофоры и биотин. С их помощью можно визуализировать локализацию dCas9 и целевой последовательности в клетке. В каталоге можно подобрать и нуклеазу Cas12, используемую, в том числе, для скрининга мутаций. Представленный на сайте фермент Cas12 еще и работает в широком диапазоне температур: от 16 до 48C.

CRISPR-Cas системы в биотехнологии

Открытие системы CRISPR-Cas привело к прорыву в области методов редактирования генома. На основе этого подхода можно относительно просто создать инструмент, который будет специфически узнавать любую выбранную последовательность и вносить разрез рядом с ней.

Методы, основанные на применении CRISPR-Cas, позволяют:

• выключить ген-мишень (нокаут гена), разрезав его. В таком случае, клетка использует процесс негомологичного соединения концов разрезанной ДНК — стандартный путь репарации двухцепочечных разрывов. Такой механизм довольно неточен, в результате чего в целевой последовательности могут образовываться делеции, инсерции и, соответственно, сдвиги рамки считывания, приводящие к потере функции гена. Такой подход используется в лабораториях для изучения функции гена и создания моделей человеческих заболеваний в других организмах.

• вставить нужную последовательность в определенный участок генома (нокин), используя процесс гомологичной рекомбинации. Такой способ работает, если в ядре есть образец для восстановления участка генома — сестринская хроматида или последовательность, предоставленная исследователем, так называемая донорная ДНК. Например, если необходимо исправить дефектную копию гена в клетке человека, достаточно внести такой двухцепочечный разрез, и система репарации восстановит целостность ДНК, используя вторую, нормальную аллель.

• направить систему на определенные последовательности в геноме патогенов или вредоносные мутации в ДНК человека. Таким образом можно проводить диагностику заболевания или же уничтожать возбудителя. Методы скрининга на основе системы CRISPR-Cas обычно связаны с использованием репортерной молекулы ДНК. Такая ДНК соединяет между собой флуорофор и тушитель флуоресценции, из-за чего свечения не происходит. После узнавания и связывания комплекса sgРНК и нуклеазы Cas с мишенью в геноме патогена, происходит разрезание не самой мишени, а репортерной ДНК. Для этого используются другие ферменты, не Cas9, а Cas12 или Cas13. В результате такой побочной реакции флуорофор и тушитель освобождаются, испускается флуоресцентный сигнал, который можно детектировать. Этот способ позволяет детектировать не только вирусы или бактерии, но и мутации в геноме человека, например, связанные с развитием рака.

• вносить не двухцепочечные, а одноцепочечные разрезы с участием двух sgРНК и повышать специфичность редактирования. Это можно сделать, если немного изменить белок Cas. Такой вариант нуклеазы называется никазой. Никаза может делать разрезы в сайтах на разных цепях ДНК, близких друг к другу. В результате ее работы получаются фрагменты с липкими концами, которые более специфично взаимодействуют с гомологичной последовательностью и уменьшают вероятность вмешательства в нецелевые участки генома.

• изменять экспрессию определенных генов в клетке. Белки Cas можно инактивировать так, чтобы они были способны связываться с мишенью, но не разрезать ее. Если слить такой инактивированный фермент с транскрипционным фактором, Cas при помощи sgРНК будет узнавать последовательность гена и связываться с ним, а транскрипционный фактор активировать или подавлять экспрессию.

• визуализировать определенные части хромосом. Если вместо транскрипционного фактора соединить с инактивированным белком Cas флуоресцентную метку, можно определить локализацию интересующей последовательности генома.