Особенности выделения ДНК под разные платформы секвенирования

10.05.2023

Секвенирование можно смело назвать одним из самых распространенных методов в молекулярной биологии, практически в каждой статье исследователи секвенируют свои образцы, а готовых решений для определения последовательности нуклеиновых кислот становится всё больше. Однако, как правило, этот этап остаётся одним из самых дорогостоящих из всего эксперимента, поэтому необходимо очень внимательно относиться к исходным образцам.

О важности контролей качества NGS-эксперимента мы уже писали статью, а в этом обзоре хотим подробнее рассмотреть особенности этапа выделения ДНК для самых распространённых платформ секвенирования, опираясь на требования и рекомендации к исходным НК от производителей соответствующих платформ.

рис1.png

Illumina

Секвенирование методом Illumina, пожалуй, одно из самых популярных среди технологий NGS. Это секвенирование коротких прочтений, то есть на этапе подготовки библиотек для секвенирования нуклеиновые кислоты первым делом фрагментируются. Поэтому, здесь нет требований к длине выделяемых НК, однако есть другие аспекты, которые важны.

Во-первых, ДНК для дальнейшей пробоподготовки должна быть двуцепочечной. А также желательно, чтобы исходный образец был свежий или подвергался минимальному количеству циклов заморозки и разморозки.

Во-вторых, количество ДНК должно быть в диапазоне 100 – 500 нг, однако для организмов с маленьким геномом это количество можно уменьшить до 1 нг (только если в подготовке библиотеки есть этап амплификации) [1].

В-третьих, есть требование к чистоте ДНК. Оптическое поглощение образца A_260/280 должно быть от 1.8 до 2.0. Если этот показатель ниже, это означает, что в образце присутствуют белки, фенол или другие загрязнения, что может негативно сказаться на эффективности пробоподготовки и дальнейшего секвенирования. А поскольку показатели поглощения не позволяют отличить ДНК от РНК, присутствие РНК может привести к увеличению этого соотношения, что также важно учитывать при дальнейшей работе [2]. Для вторичной оценки чистоты образца используют показатель A_260/230, который должен быть в диапазоне 2.0 - 2.2, если он ниже, это также может означать присутствие белков, солей, липидов, углеводов и ЭДТА.

Причем важно проводить оценку концентрации на флуориметре или методом ПЦР, а проверять чистоту образца на спектрофотометре.

Таким образом, при выделении ДНК для дальнейшего секвенирования на платформе Illumina следует обратить внимание на выход и чистоту образца. Для такой задачи лучше всего подойдет технология выделения на спин-колонках, например, набор "SKYamp Genomic DNA Kit". Первое преимущество этого метода в том, что он достаточно быстр, то есть вы сможете выделить ДНК, подготовить библиотеки и запустить секвенирование за один день. Также данный набор совместим с широким спектром биологических материалов и подойдёт для выделения ДНК из крови, различных тканей и клеток животных и человека, что упрощает работу при использовании разных исходных образцов. Набор гарантирует выход от 3 до 10 мкг ДНК при выделении из крови, и до 30 мкг ДНК при выделении из клеток и тканей, что в разы превышает необходимое количество для дальнейшей подготовки библиотек. Также протокол включает несколько этапов промывки, что позволяет достичь высокой степени очистки получаемой ДНК и избавиться от различных ингибиторов и контаминантов.

Для секвенирования РНК подходят те же требования к выделению исходного образца, поскольку следующим этапом РНК конвертируется в кДНК и секвенируется уже кДНК.

Ion Torrent

При подготовке к секвенированию методом Ion Torrent, исходная ДНК тоже фрагментируется, поэтому особых требований к длине фрагментов нет, а этап отбора по размеру происходит позже, уже при пробоподготовке библиотек.

Аналогично требованиям при секвенировании на платформе Illumina, ДНК должна быть высокой степени очистки - A_260/280 от 1.8 до 2.0, а диапазон концентрации для большинства наборов для подготовки библиотек от 10 нг до 1 мкг ДНК [3,4].

Кстати, чтобы получить ДНК хорошего качества и в достаточном количестве при выделении из агарозного геля, рекомендуем набор "SKYGel Purification". Этот набор позволяет выделить до 10 мкг ДНК высокой степени очистки на спин-колонках всего за 10 минут!

MGI

Для этой технологии требования к чистоте ДНК такие же, как и для платформ Illumina и Ion Torrent - A260/280 от 1.8 до 2.0. При использовании наборов для пробоподготовки от MGI производитель рекомендует использовать уже фрагментированную ДНК длиной 100 – 700 п.о., со средней длиной фрагментов 250-300 п.о., а количество ДНК должно быть от 0,5 до 50 мкг [5]. Если вы используете наборы других производителей, например, набор «VAHTS Universal Plus V2 DNA» от Vazyme, то исходное количество ДНК может быть от 100 пкг до 1 мкг. В инструкции к набору есть рекомендации в зависимости от типа образца и задачи, к примеру, для полногеномного секвенирования образца из FFPE-блока нужно взять от 50 мкг ДНК для дальнейшей подготовки библиотеки [6].

Получить ДНК по таким требованиям поможет набор "SKYAmp FFPE DNA". Принцип набора основан на депарафинизации с помощью ксилола, после чего происходит лизис фрагмента ткани и очистка препарата ДНК на спин-колонках, а также в специальных буферах. Набор гарантирует выход до 70 мкг ДНК и полное удаление загрязняющих веществ и ингибиторов, что делает его идеальным решением для такой задачи. Кстати, если вы хотите секвенировать РНК, то вам также подойдет набор "SKYprep RNA Pure FFPE Kit".

Oxford Nanopore Technologies

Эта технология очень популярна в России и во всём мире благодаря возможности секвенировать длинные прочтения, что позволяет решать различные задачи, которые невозможно реализовать другими технологиями.

Поэтому, есть требования по длине исходной ДНК – средний размер фрагмента должен быть не менее 30 кб. Для определения размера фрагментов в выделенном образце ДНК можно использовать гели (система Bio-Rad CHEF), приборы Agilent ( Tapestation или FEMTO Pulse).

Требования к чистоте образца схожи с параметрами для других платформ, стоит избегать химических примесей, таких как детергенты, денатуранты, хелатирующие агенты и высокие концентрации солей, поскольку они могут повлиять на эффективность ферментативных стадий.

Что касается количества, то мы рекомендуем брать 1 мкг ДНК на входе, особенно если у вас образец с большим разбросом по длине фрагментов. А если вы секвенируете ампликоны, то это количество можно существенно уменьшить [7].

Однако эксперимент по секвенированию длинных прочтений ставит перед исследователем задачу по выделению длинных фрагментов ДНК. В целом, для получения ДНК длиной около 30 кб можно использовать технологию выделения на спин-колонках, но для достижения лучшего эффекта мы рекомендуем использовать магнитное выделение, поскольку в нем отсутствуют такие жесткие этапы, как центрифугирование, при котором ДНК рвётся [8]. Например, с выделением геномной ДНК из крови отлично справится набор "SKYMag Blood Genomic DNA". Он предназначен для изоляции ДНК из 100 мкл – 1 мл цельной крови, и в зависимости от исходного объема образца можно получить до 25 мг ДНК. А ещё это набор может быть использован не только для ручного выделения, но и для выделения на автоматических станциях.

Как видите, в целом требования к выделению ДНК для разных платформ схожи, но есть и отдельные нюансы. Также рекомендации могут немного варьировать в зависимости от задачи, которую ставит перед собой исследователь. Но для большинства задач подойдут наборы линейки SkyGen NA Extraction, если вам нужна помощь в подборе реагентов, отправьте заявку на sales@skygen.com и наши специалисты помогут выбрать подходящие наборы.