3 этапа контроля качества, которые должен знать любой NGS-исследователь

Любой добропорядочный исследователь знает, насколько важно ставить контроли своих экспериментов, поскольку это не только позволяет правильно понять происходящее в пробирке, но и исключить возможные ошибки, снизить затраты и сэкономить время работы. 

Контроли качества образцов на основных этапах NGS - не исключение. Много исследований было направлено на то, чтобы понять, какие именно показатели контроля качества важны для экспериментов по NGS, в первую очередь, из-за их высокой стоимости. Игнорирование оценки промежуточных результатов приводит к потери времени и ресурсов, поэтому мы хотим поговорить о том, по каким параметрам оценивать свой эксперимент и на каких этапах нужен этот контроль.

А что, если не проводить промежуточные контроли качества?

Мы собрали несколько статей для того, чтобы вы наглядно смогли увидеть, насколько важно ставить контроли качества своих образцов.

1. Влияние деградации РНК на данные NGS секвенирования транскриптома.
   В этой работе исследователи воспроизвели процесс деградации РНК путем поддержания клеток при комнатной температуре для достижения разной степени разрушения РНК (и уменьшения показателя RIN). Затем они отсеквенировали мРНК и длинные некодирующие РНК (lncRNA) в каждой группе образцов с разным уровнем RIN. Результаты показали, что данные о lncRNA имели существенные различия даже при незначительном уровне деградации РНК по сравнению с образцом недеградированной РНК. Таким образом, исследователи пришли к выводу, что данные РНК-секвенирования могут очень сильно отличаться в зависимости от уровня деградации исходного образца РНК [1].
2. Влияние целостности ДНК на успех NGS секвенирования образцов тканей.
   Данная работа показала, что целостность исходной ДНК является одним из наиболее важных факторов, определяющих успех NGS секвенирования. Здесь учёные оценивали качество ДНК в образцах FFPE и пришли к выводу, что от этого напрямую зависят полученные результаты [2].
3. Влияние контаминации образца ДНК на результаты NGS.
   В этом исследовании было оценено влияние таких контаминантов, как коллаген, миоглобин и меланин на результаты NGS. Было доказано, что данные компоненты образцов кожи и мышц оказывают существенное негативное воздействие на качество ридов, а выбор протокола для выделения и очистки ДНК и последующий контроль её качества играют большую роль [3].

Итак, очевидно, что проводить контроли качества просто необходимо. Теперь рассмотрим некий стандартный эксперимент по секвенированию методом NGS, он состоит из нескольких этапов: получение биоматериала, выделение и очистка нуклеиновых кислот (ДНК или РНК), подготовка НК-библиотеки для секвенирования (может отличаться в зависимости от технологии и протокола), загрузка в секвенатор и секвенирование, дальнейший анализ полученных данных.

Такой обобщенный эксперимент должен содержать три контроля качества образцов: контроль выделенной НК, контроль полученной библиотеки и контроль качества полученных данных после секвенирования.

Контроль качества выделенной НК

Этап выделения нуклеиновых кислот очень важен, поскольку от качества полученной НК, по сути, зависит успех всего дальнейшего эксперимента. У разных технологий NGS могут отличаться требования к образцу на этом этапе, но для всех них важно оценить его количество и качество. 

Какие же параметры необходимо измерить на этом этапе:

• Концентрация
• Чистота
• Целостность

Как правило, для оценки первых двух параметров исследователи используют метод спектрофотометрии, измеряя оптическое поглощение образца при определённой длине волны. Например, при помощи спектрофотометра NanoDrop (Thermo Fisher), который позволяет проводить измерения всего в 1 – 2 мкл образца. Однако, у этого метода есть погрешности, особенно при определении концентрации (при измерении концентрации ДНК, следы РНК и белков в образце могут искажать результаты). Поэтому для измерения концентрации используют метод флуориметрии, которая позволяет специфично окрасить ДНК и провести точные измерения. Для контроля этого параметра отлично подойдет флуориметр Qubit (Thermo Fisher) и расходные реагенты к нему ( Vazyme).

Для измерения показателя целостности ДНК и РНК (DIN и RIN) подойдет электрофоретический анализ, в частности более современная его разновидность – автоматический капиллярный гель-электрофорез. Этот метод самый точный и универсальный, с его помощью можно получить не только данные о размере НК, но и о чистоте, концентрации, так что он может заменить предыдущие два метода. Для этого отлично подойдут такие автоматизированные станции как TapeStation 4150 и 4200 (Agilent Technologies).

Почему лучше автоматизировать этот процесс? Во-первых, таким образом удастся сократить рабочее время, ведь загрузка образцов займет всего пару минут, а результаты будут готовы уже в течение 20 минут. Во-вторых, это самый точный способ получения нужных данных в такие короткие сроки, а ещё, удастся снизить фактор человеческой ошибки.

Agilent Technologies также поставляют широкий спектр расходных материалов для эксперимента – ScreenTape. ScreenTape – это по сути такой чип с капиллярами, заполненными гелем. Всё, что остаётся сделать исследователю – нанести образцы на тейп, поместить его в прибор и запустить соответствующую программу.

Тейпы отличаются в зависимости от вида НК, исходного биоматериала и задачи: уже подобраны оптимальные условия и подходящий маркер.

Контроль качества полученной библиотеки

После подготовки библиотек, независимо от типа дальнейшего секвенирования, необходимо их проверить на концентрацию (выход), чистоту и длину фрагментов. Здесь применимы все те же методы, описанные в предыдущем разделе, а при работе с системами TapeStation удобно использовать тейп «High Sensitivity D1000 ScreenTape Assay». Для такой работы понадобится всего 1 мкл образца, а тейп позволит разделить фрагменты библиотеки длиной до 5 000 п.о.

Измерить эти параметры действительно важно, поскольку для дальнейшей работы необходимо знать, какой объем библиотеки загружать в секвенатор, подходящей ли длины фрагменты в нашем образце и нет ли загрязнений, которые могут негативно сказаться на результатах секвенирования (например, наличие димеров адаптеров).

Контроль качества секвенирования

После получения сырых данных их тоже можно проверить, например, при помощи сервиса FastQC. Эта программа позволяет дать общую оценку на адекватность вашим данным секвенирования, прежде, чем вы начнёте их обрабатывать. Такой этап поможет избежать лишней работы, в случае если с результатами возникли какие-то проблемы.

Таким образом, мы рассмотрели, почему необходимо проводить контроли качества после выделения НК, подготовки библиотеки и секвенирования, и какими инструментами это можно сделать. Мы желаем вам успешных и качественных экспериментов, а мы в свою очередь предоставим вам всё необходимое оборудование, реагенты и расходные материалы.

[1] Impact of RNA degradation on next-generation sequencing transcriptome data Author links open overlay panel. Wenxiang Lu, Qin Zhou, Yi Chen, Genomics, Volume 114, Issue 4, July 2022, 110429
[2] Impact of DNA integrity on the success rate of tissue‐based next‐generation sequencing: Lessons from nationwide cancer genome screening project SCRUM‐Japan GI‐SCREEN. Kuwata T, Wakabayashi M, Hatanaka Y, Morii E, Oda Y, Taguchi K, Noguchi M, Ishikawa Y, Nakajima T, Sekine S, Nomura S, Okamoto W, Fujii S, Yoshino T; SCRUM-Japan GI-SCREEN Pathology Group. Pathol Int. 2020 Dec;70(12):932-942. doi: 10.1111/pin.13029. Epub 2020 Oct 8. PMID: 33030786; PMCID: PMC7820973.
[3] Impact of DNA contaminants on next-generation sequencing data quality. Amy Dubinsky, Lauren Saunders In: Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual Meeting 2021; 2021 Apr 10-15 and May 17-21. Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res 2021;81(13_Suppl):Abstract nr 2281.