#62 Новое решение Visium от 10x Genomics для анализа пространственной экспрессии генов

Существующие технологии 10x Genomics уже сейчас позволяют анализировать геномы и транскриптомы единичных клеток путем NGS-секвенирования. Но компания решила пойти еще дальше и разработала технологию Visium для анализа распределения экспрессионных профилей клеток в пространстве. Это совершенно новый подход к исследованию динамики молекулярных процессов в биологических образцах.

Компоненты системы Visium

Как и прочие протоколы от 10x Genomics, Visium представляет собой готовое решение и включает:

• Слайды для визуализации образцов и захвата транскриптов,
• Реагенты для захвата транскриптов и синтеза кДНК,
• Слайды и реагенты для оптимизации условий пермеабилизации,
• Реагенты для подготовки РНК-библиотеки (3’),
• Программное обеспечение для биоинформатической обработки данных.

Описание технологии Visium

Общая схема подготовки NGS-библиотеки для анализа пространственной экспрессии генов с помощью технологии Visium выглядит следующим образом.

Рис. 1. Общая схема технологии Visium.

Протокол начинается с подготовки 4-х срезов ткани толщиной 10-50 мкм и их размещении на специальных слайдах в 4-х зонах захвата транскриптов.

Рис. 2. Устройство слайда Visium для анализа пространственной экспрессии генов.

Каждая такая зона состоит из 5 000 точек захвата транскриптов. Точка захвата представляет собой группу олигонуклеотидов, закрепленных на подложке. Диаметр каждой точки – 55 мкм, а расстояние между ними – 100 мкм. В зависимости от типа ткани и толщины среза на одну точку может приходиться 1-10 клеток.

Последовательность олигонуклеотидов включает в себя адаптер R1 (стандартный адаптер TruSeq), баркод Spatial, метку UMI и поли-dT-хвост. Баркод Spatial уникален для каждой точки захвата транскриптов.

После размещении среза ткани на слайде ее фиксируют и окрашивают гематоксилин-эозином. Подготовленный препарат визуализируют с помощью микроскопа и фотографируют.

Рис. 3. Микроскопия и фотографирование подготовленного препарата срезов ткани.

Затем слайд вставляют в специальный адаптер, имеющий отверстия напротив зон захвата. Таким образом образуются лунки, дном которых выступают срезы тканей и куда можно вносить реагенты.

Рис. 4. Слайд Visium в адаптере.

Следующий этап протокола – пермеабилизация клеток. Ее выполняют путем добавления в лунки специальных ферментов и инкубации адаптера со слайдом при 37°C. При этом мРНК покидают образец и связываются с поли-dT-хвостами олигонуклеотидов зон захвата.

Рис. 5. Пермеабилизация клеток среза.

Далее следуют этапы синтеза кДНК методом обратной транскрипции с переключением матрицы, денатурации и удаления мРНК, синтеза второй цепи кДНК, денатурации и переноса второй цепи кДНК в пробирки.

Рис. 6. Синтез первой и второй цепи кДНК на слайде Visium.

На последней стадии вторую цепь кДНК используют для подготовки NGS-библиотек, включающую в себя:

• Оценку качества кДНК,
• Амплификацию кДНК,
• Фрагментацию / восстановление концов / 3'-аденилирование концов,
• Лигирование адаптеров,
• Индексирующую ПЦР,
• Контроль качества библиотеки.

Рис. 7. Структура фрагментов библиотеки, подготовленной по технологии Visium.

Готовую библиотеку можно секвенировать на любой платформе Illumina®. Глубина прочтений должна составлять не менее 50 000 пар ридов на одну зона захвата мРНК (то есть на один баркод Spatial). Режим прочтения – 28 x 120 н.п.

Оптимизация условий пермеабилизации в протоколе Visium

Перед тем как приступать к исследованию новых типов тканей, рекомендуется оптимизировать длительность ферментативной пермеабилизации для максимально эффективного захвата мРНК. Для этих целей 10x Genomics разработал специальный набор слайдов и реагентов.

Слайды для оптимизации имеют уже 8 зон захвата мРНК, но размещают на них всего 7 срезов ткани. Одна зона предназначена для положительного контроля, в качестве которого используют референсную мРНК. Закрепленные на подложке олигонуклеотиды не содержат баркодов и состоят из одного поли-dT-хвоста.

После стандартной подготовки, окраски, фиксации и фотографировании срезов ткани на слайде его вставляют в адаптер и приступают к подбору условий пермеабилизации.

Для этого в лунку без среза ткани для положительного контроля добавляют референсную РНК, в лунку со срезом для положительного контроля не добавляют ничего. В остальные же лунки через определенные промежутки времени добавляют ферментативную смесь для пермеабилизации, инкубируя слайд при 37° C.

Далее лунки промывают и добавляют в них реакционную смесь для обратной транскрипции, которая содержит дЦТФ, меченный флуоресцентным красителем Cyanine 3. И в ходе обратной транскрипциии синтезируется флуоресцентно меченная кДНК.

На следующем этапе с помощью ферментов со слайдов удаляют ткани и методом флуоресцентной микроскопии оценивают эффективность захвата мРНК при разной длительности пермеабилизации. Наилучшие условия используют в дальнейшем при работе с опытными образцами.

Рис. 8. A - Срезы ткани на слайде Visium для оптимизации условий пермеабилизации.B - Оценка зависимости эффективности захвата мРНК от длительности пермеабилизации: Pos и Neg – положительный и отрицательный контроли; 3, 6, 12, 18, 24 и 30 – длительность пермеабилизации в минутах.

Обработка данных секвенирования библиотек пространственной экспрессии Visium

Первичную и вторичную обработку данных секвенирования выполняют с помощью бесплатного программного обеспечения Space Ranger и Loupe Browser.

ПО осуществляет выравнивание полученных ридов и фотографий, сделанных на этапе подготовки препарата. Баркод Spatial помогает определить, в какой точке был захвачен тот или иной транскрипт.

Результаты обработки можно вывести в виде наглядных отчетов. Они содержат информацию об общем числе точек, в которых произошел захват, числе ридов, приходящихся на одну точку захвата, числе генов, экспрессирующихся в точках захвата, и многие другие показатели.

Рис. 9. Пример отчета, сформированного программным обеспечением Space Ranger.

Также можно визуализировать пространственную экспрессию конкретных генов и кластеризировать точки захвата на основании экспрессионных профилей нескольких генов.

Рис. 10. Результаты анализа пространственной экспрессии генов в головном мозге мыши по технологии Visium: A – корональный срез, окрашенный гематоксилин-эозином, B – пространственное распределение меток UMI, C – пространственное распределение экспрессии генов, D – пространственная кластеризация экспрессии 8 генов.

Рис. 11. Пространственная экспрессия генов Hpca (A) и Selenow (B) в головном мозге мыши. Транскрипты обоих генов хорошо представлены в гиппокампе (белый прямоугольник), что согласуется с известными паттернами экспрессии.

Типы тканей, совместимые с технологией Visium

Технология совместима с различными тканями человека, мыши и крысы. Их фиксацию можно выполнять метанолом.

Ниже перечислены типы тканей, совместимость которых с системой Visium была валидирована:

Информация для заказа

Каталог →