Существующие технологии 10x Genomics уже сейчас позволяют анализировать геномы и транскриптомы единичных клеток путем NGS-секвенирования. Но компания решила пойти еще дальше и разработала технологию Visium для анализа распределения экспрессионных профилей клеток в пространстве. Это совершенно новый подход к исследованию динамики молекулярных процессов в биологических образцах.
Как и прочие протоколы от 10x Genomics, Visium представляет собой готовое решение и включает:
Общая схема подготовки NGS-библиотеки для анализа пространственной экспрессии генов с помощью технологии Visium выглядит следующим образом.
![]() |
Рис. 1. Общая схема технологии Visium.
|
Протокол начинается с подготовки 4-х срезов ткани толщиной 10-50 мкм и их размещении на специальных слайдах в 4-х зонах захвата транскриптов.
![]() |
Рис. 2. Устройство слайда Visium для анализа пространственной экспрессии генов.
|
Каждая такая зона состоит из 5 000 точек захвата транскриптов. Точка захвата представляет собой группу олигонуклеотидов, закрепленных на подложке. Диаметр каждой точки – 55 мкм, а расстояние между ними – 100 мкм. В зависимости от типа ткани и толщины среза на одну точку может приходиться 1-10 клеток.
Последовательность олигонуклеотидов включает в себя адаптер R1 (стандартный адаптер TruSeq), баркод Spatial, метку UMI и поли-dT-хвост. Баркод Spatial уникален для каждой точки захвата транскриптов.
После размещении среза ткани на слайде ее фиксируют и окрашивают гематоксилин-эозином. Подготовленный препарат визуализируют с помощью микроскопа и фотографируют.
![]() |
Рис. 3. Микроскопия и фотографирование подготовленного препарата срезов ткани.
|
Затем слайд вставляют в специальный адаптер, имеющий отверстия напротив зон захвата. Таким образом образуются лунки, дном которых выступают срезы тканей и куда можно вносить реагенты.
Рис. 4. Слайд Visium в адаптере.
|
Следующий этап протокола – пермеабилизация клеток. Ее выполняют путем добавления в лунки специальных ферментов и инкубации адаптера со слайдом при 37°C. При этом мРНК покидают образец и связываются с поли-dT-хвостами олигонуклеотидов зон захвата.
![]() |
Рис. 5. Пермеабилизация клеток среза.
|
Далее следуют этапы синтеза кДНК методом обратной транскрипции с переключением матрицы, денатурации и удаления мРНК, синтеза второй цепи кДНК, денатурации и переноса второй цепи кДНК в пробирки.
![]() |
Рис. 6. Синтез первой и второй цепи кДНК на слайде Visium.
|
На последней стадии вторую цепь кДНК используют для подготовки NGS-библиотек, включающую в себя:
![]() |
Рис. 7. Структура фрагментов библиотеки, подготовленной по технологии Visium.
|
Готовую библиотеку можно секвенировать на любой платформе Illumina®. Глубина прочтений должна составлять не менее 50 000 пар ридов на одну зона захвата мРНК (то есть на один баркод Spatial). Режим прочтения – 28 x 120 н.п.
Перед тем как приступать к исследованию новых типов тканей, рекомендуется оптимизировать длительность ферментативной пермеабилизации для максимально эффективного захвата мРНК. Для этих целей 10x Genomics разработал специальный набор слайдов и реагентов.
Слайды для оптимизации имеют уже 8 зон захвата мРНК, но размещают на них всего 7 срезов ткани. Одна зона предназначена для положительного контроля, в качестве которого используют референсную мРНК. Закрепленные на подложке олигонуклеотиды не содержат баркодов и состоят из одного поли-dT-хвоста.
После стандартной подготовки, окраски, фиксации и фотографировании срезов ткани на слайде его вставляют в адаптер и приступают к подбору условий пермеабилизации.
Для этого в лунку без среза ткани для положительного контроля добавляют референсную РНК, в лунку со срезом для положительного контроля не добавляют ничего. В остальные же лунки через определенные промежутки времени добавляют ферментативную смесь для пермеабилизации, инкубируя слайд при 37° C.
Далее лунки промывают и добавляют в них реакционную смесь для обратной транскрипции, которая содержит дЦТФ, меченный флуоресцентным красителем Cyanine 3. И в ходе обратной транскрипциии синтезируется флуоресцентно меченная кДНК.
На следующем этапе с помощью ферментов со слайдов удаляют ткани и методом флуоресцентной микроскопии оценивают эффективность захвата мРНК при разной длительности пермеабилизации. Наилучшие условия используют в дальнейшем при работе с опытными образцами.
![]() |
Рис. 8. A - Срезы ткани на слайде Visium для оптимизации условий пермеабилизации.B - Оценка зависимости эффективности захвата мРНК от длительности пермеабилизации: Pos и Neg – положительный и отрицательный контроли; 3, 6, 12, 18, 24 и 30 – длительность пермеабилизации в минутах. |
Первичную и вторичную обработку данных секвенирования выполняют с помощью бесплатного программного обеспечения Space Ranger и Loupe Browser.
ПО осуществляет выравнивание полученных ридов и фотографий, сделанных на этапе подготовки препарата. Баркод Spatial помогает определить, в какой точке был захвачен тот или иной транскрипт.
Результаты обработки можно вывести в виде наглядных отчетов. Они содержат информацию об общем числе точек, в которых произошел захват, числе ридов, приходящихся на одну точку захвата, числе генов, экспрессирующихся в точках захвата, и многие другие показатели.
![]() |
Рис. 9. Пример отчета, сформированного программным обеспечением Space Ranger. |
Также можно визуализировать пространственную экспрессию конкретных генов и кластеризировать точки захвата на основании экспрессионных профилей нескольких генов.
![]() |
Рис. 10. Результаты анализа пространственной экспрессии генов в головном мозге мыши по технологии Visium: A – корональный срез, окрашенный гематоксилин-эозином, B – пространственное распределение меток UMI, C – пространственное распределение экспрессии генов, D – пространственная кластеризация экспрессии 8 генов. |
![]() |
Рис. 11. Пространственная экспрессия генов Hpca (A) и Selenow (B) в головном мозге мыши. Транскрипты обоих генов хорошо представлены в гиппокампе (белый прямоугольник), что согласуется с известными паттернами экспрессии.
|
Технология совместима с различными тканями человека, мыши и крысы. Их фиксацию можно выполнять метанолом.
Ниже перечислены типы тканей, совместимость которых с системой Visium была валидирована:
Ткань | Толщина среза | Ткань | Толщина среза |
Человек | Мышь | ||
Головной мозг (мультиформная глиобластома) | 10 мкм | Головной мозг (здоровый) | 10 мкм |
Грудь (здоровая) | 10-20 мкм | Глаза (здоровые) | 10 мкм |
Грудь (инвазивная протоковая карцинома) | 10-20 мкм | Сердце (здоровое) | 10 мкм |
Грудь (инвазивная лобулярная карцинома) | 10-20 мкм | Почки (здоровые) | 10 мкм |
Сердце (здоровое) | 10 мкм | Толстый кишечник (здоровый) | 10 мкм |
Почки (здоровые) | 10 мкм | Печень (здоровая) | 10 мкм |
Почки (нефрит) | 10 мкм | Легкие (здоровые) | 10 мкм |
Толстый кишечник (колоректальный рак) | 10-20 мкм | Яичники (здорове) | 10 мкм |
Легкие (папиллярная карцинома) | 10 мкм | Квадрицепс (здоровый) | 10 мкм |
Лимфоузлы (здоровые) | 10 мкм | Тонкий кишечник (здоровый) | 10 мкм |
Лимфоузлы (воспаленные) | 10 мкм | Селезенка (здоровая) | 10 мкм |
Яичники (опухоль) | 10 мкм | Желудок (здоровый) | 10 мкм |
Селезенка (воспаленная) | 10 мкм | Семенники (здоровые) | 10 мкм |
Крыса | Щитовидная железа (здоровая) | 10 мкм | |
Головной мозг (здоровый) | 10 мкм | Язык (здоровый) | 10 мкм |
Сердце (здоровое) | 10 мкм | ||
Почки (здоровые) | 10 мкм |
Артикул | Наименование |
1000184 | Набор слайдов и реагентов для пространстраственной экспрессии генов Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 16 реакций |
1000187 | Набор слайдов и реагентов для пространстраственной экспрессии генов Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 реакции |
1000193 | Набор слайдов и реагентов для оптимизации срезов ткани Visium Spatial Tissue Optimization Slide & Reagent Kit, 4 реакции |
1000194 | Набор дополнительных аксессуаров Visium Accessory Kit |
1000200 | Стартовый набор Visium для пространственного анализа экспрессии Visium Spatial Gene Expression Starter Kit |
1000215 | Набор индексов для библиотеки пространственной экспрессии Dual Index Kit TT, Set A 96 реакций |
Новости
Вебинары
Акции
Мероприятия
Обзоры
Мы в соцсетях