#16 Обновление линейки NEBNext для пробоподготовки для секвенирования NGS

Введение

Появление новых продуктов для секвенирования NGS развивается по нескольким параллельным направлениям. В первую очередь новые продукты определяются новыми задачами по повышению точности амплификации библиотеки. Было показано, что замена ДНК-полимеразы Q5 на Q5 Hot Start улучшает качество этапа амплификации и, следовательно, секвенирования. 

В то же время, для оптимизации секвенирования, ведутся работы для обогащения образцов ДНК (например, ДНК микробиома), образцов РНК (избавление от рибосомальной РНК в образце).

Для улучшения качества ДНК, которая подвергается секвенированию (например, ДНК из образцов тканей, зафиксированных формальдегидом в парафине) - также появилось решение.

Также, для увеличения возможного количества метод для секвенирования большого количества образцов одновременно был выпущен набор олигонуклеотидов с двойным баркодированием, который позволяет зашифровать в один прогон Illumina до 96 образцов. Также, для ДНК, обработанной бисульфитом, мы можем предложить наборы олигонуклеотидов с метилированными адаптерами.

1. Готовая смесь NEBNext® для HiFi ПЦР с Q5 Hot Start

Преимущества новой смеси для высокоточной апмлификации для HiFi ПЦР с Q5 Hot Start:

Реализация механизма Hot Start (основанного на аптамерах), позволяет деактивировать ДНК-полимеразу до момента, когда происходит нагревание смеси

Минимизация ошибок во время амплификации GC-богатых участков

Высокий выход

Амплификация с ультра-низким количеством ошибок

Совместимость с AMPure частицами, другими магнитными методами разделения, используемых в NGS протоколе

Устойчивость к оверциклизации

В составе наборов NEBNext поставляется новая версия смеси для амплификации. Необходимо обратить внимание на изменение параметров циклизации. В результате выпуска новой смеси для амплификации NEBNext Q5 Hot Start Hifi, были внесены некоторые изменения в другие компоненты наборов NEBNext, в том числе в концентрации олигонуклеотидов. Смесь для амплификации с Phusion ДНК-полимеразой/Q5 ДНК-полимеразой более не поставляется с наборами. В то же время все варианты готовой смеси с различными ДНК-полимеразами доступны для отдельной продажи.

2. Смесь ферментов NEBNext для восстановления ДНК, выделенной из фиксированных тканей

Специально для лабораторий, которые получают образцы для секвенирования следующего поколения NGS в виде тканей, зафиксированных в формалине (т.н. FFPE образцы), мы рады предложить новинку линейки NEBNext - набор для восстановления ДНК, выделенной из зафиксированных тканей.

Специально для лабораторий, которые получают образцы для секвенирования следующего поколения NGS в виде тканей, зафиксированных в формалине, мы рады предложить новинку линейки NEBNext - набор для восстановления ДНК, выделенной из зафиксированных тканей.

Во время фиксации образцов тканей формалином парафине вызывает разрушение нуклеиновых кислот. В результате, трудно получить требуемую информацию, особенно при секвенировании NGS. Коктейль восстанавливающих ферментов был специально оптимизирован для восстановления такие FFPE образцов. В таблице показано, какие типы повреждений исправляют при помощи набора.

При сравнении выхода библиотеки в количестве - в случае образцов печени (нормальная ткань), зафиксированной формалином в парафине, и после хранения в течение 11 лет, при использовании набора выход увеличивался в 3 раза. Для злокачественных образцов желудка и поджелудочной железы, хранившихся в течение 2 и 4 лет - выход увеличивается в 2 раза.

Типы повреждений ДНК, восстанавливаемые при помощи набора

Деаминирование цитозина в урацил

Выщепление основний

Окисление основний

Блокирование 3'-конца

Фрагментация ДНК

Сшивки между ДНК и протеинами

3. Набор для избавления от рибосомальной РНК NEBNext (человеческая/мышиная/крысиная)

Метод, основанный на использовании РНКазы Н, позволяет растворить как цитоплазматическую (5S rRNA, 5.8S rRNA, 18S rRNA and 28S rRNA), так и митохондриальную рибосомальную РНК (12S rRNA and 16S rRNA) из препаратов тотальной РНК человека. Набор подходит для использования как с цельной, так и с деградировавшей РНК (например РНК из образцов тканей, зафиксированных при помощи формалина в парафине). Полученная в результате обогащенная РНК подходит для секвенирования РНК, синтеза кДНК со случайными праймерами и других методов анализа РНК.

Рис.1 Эффективность удаления рибосомальной РНК из целой и поврежденной РНК (FFPE), для кодирующих и некодирующих транскриптов
Библиотеки РНК были созданы из универсальной стандартной тотальной РНК (UHR, Agilent) или FFPE образцов опухоли груди (хранившейся в течение 1 и 10 лет). РНК была обогащена с использованием модуля NEBNext® для выделения поли(А)+ мРНК с помощью магнитных шариков или набором NEBNext для избавления от рибосомальной РНК (РНК человека, мышей, крыс).

Библиотеки были приготовлены с использованием набора реактивов NEBNext® Ultra Directional для создания библиотек РНК на платформе Illumina®.

Количество прочтений были картированы по hg19 геному, а распределение было определено с использованием Picard RNA-seq Metrics.

Библиотеки, полученные с использованием набора для обогащения РНК характеризовались сравнительно низким количеством количеством прочтений рибосомальной РНК, по сравнению с библиотеками, для которых использовался модуль для выделения мРНК. В то же время количество прочтения некодирующих регионов оставалось сравнительно тем же. Эффективность избавления от рибосомальной РНК сохранялась в том числе и для образцов FFPE. 

4. Набор NEBNext для обогащения ДНК микробиома

Зачастую генетические исследования микробиома, в частности, полное секвенирование генома, затруднены из-за сложности отделения ДНК микробов от ДНК хозяина. Набор NEBNext® для обогащения ДНК микробиома представляет собой простой и быстрый инструмент для удаления из образца хозяйской ДНК и обогащения в нем ДНК микроорганизмов. Метод разделения двух видов ДНК основан на различиях в метилировании геномов разных организмов. Для геномной ДНК человека характерно CpG метилирование (4-5%), у микроорганизмов такой тип метилирования встречается крайне редко (до 0.1%).

Ключевым компонентом набора является белок MDB2-Fс, состоящий из белка MDB2, связывающего метилированную по CpG динуклеотидам ДНК, и Fc-фрагмента IgG человека, связывающегося с белком А, иммобилизованным на магнитных шариках, которые также входят в состав набора.

На первом этапе разделения происходит смешивание белка MDB2-Fс и магнитных шариков с белком А, в результате которого происходит образование комплексов MDB2-Fс-магнитные шарики. К этим комплексам добавляют образец ДНК, при этом метилированная ДНК связывается с белком MDB2, а неметилированная ДНК микроорганизмов остается в растворе.

Используя магнитный штатив, нужно аккуратно отобрать раствор микробной ДНК. После очистки раствора одним из стандартных методов его можно использовать в последующих приложениях, в том числе в качестве матрицы для ПЦР, ПЦР в реальном времени, секвенирования и секвенирования следующего поколения на платформах Illumina®, Ion Torrent™, SOLiD™, 454™. При желании ДНК хозяина можно элюировать с магнитных шариков, очистить и использовать для дальнейшего изучения.

Рис.2. Результаты секвенирования образца слюны человека с обогащением и без

5.Набор мультиплексных олигонуклеотидов NEBNext® для Illumina® (метилированный адаптер, набор индексов 1)

Набор мультиплексных олигонуклеотидов NEBNext для Illumina с метилированным адаптером (набор индексов 1) содержит адаптеры и праймеры, которые были сконструированы специально для мультиплексирования образцов при полногеномном секвенировании обработанных бисульфитом на платформе illumina. 

Каждый компонент набора проходит контроль качества, что контролируется по номеру лота - как отдельно, так и в составе набора. Компоненты проходят тестирование все вместе, используются для конструирования и секвенирования библиотек ДНК, конвертируемых бисульфитом, на платформе Illuimina.

6. Набор олигонуклеотидов NEBNext с двойным баркодированием для Illumina (набор индексов 1)

Набор олигонуклеотидов с двойным баркодированием содержит адаптор и праймеры с индексами, которые специально разработаны для мультиплексирования образцов, до 96 образцов, во время приготовления библиотек для секвенирования следующего поколения.

Комбинация 8 различных индексов с одной стороны и 12 индексов с другой - позволяет получить 96 комбинаций.

Заключение
 

Мы надеемся, что данный обзор поможет углубить знания в области секвенирования NGS, и оптимизировать работу с наборами для пробоподготовки NEBNext от New England Biolabs.