#7 Буферы от New England Biolabs: инструкция к действию

Прежде всего, давайте остановимся на тех случаях, когда к одному ферменту предлагается на выбор несколько типов буферных растворов. Все поставляемые ферменты прибывают к потребителю вместе с буферным раствором, и как правило, тип буфера выбирается уже на момент заказа.

Буферные растворы для Taq ДНК-полимеразы

NEB предлагает три различных буферных раствора для использования с Taq ДНК-полимеразой. Каждый из них может поставляться как с Mg2+, так и без.

Это стандартный Taq буферный раствор: не содержит детергенты и создан для того, чтобы подходить для всех существующих протоколов. Поставляется с ДНК-полимеразой со стандартным буфером и ДНК-полимеразой со стандартным буфером (без Mg2+).

Другой разновидностью буфера является ThermoPol®, который был создан для оптимизации выхода и специфичности ДНК-полимераз. Поставляется с ДНК-полимеразой Taq с буфером ThermoPol™ и ДНК-полимеразой Taq с ThermoPol™ II (без Mg2+).

И наконец, предлагается специальный буферный раствор ThermoPol (свободный от детергентов) для специальных задач. Все данные буферные растворы могут также быть использованы и с некоторыми другими термофильными ДНК-полимеразами.

Буферные растворы для использования с OneTaq ДНК-полимеразой

Для образцов с различным содержанием GС, предлагается использовать различные буферные растворы. Для образцов с <50% GC рекомендуется стандартный буферный раствор OneTaq. При 50–65% GC также рекомендуется стандартный OneTaq буферный раствор. Однако при сложных ампликонах возможно использовать буферный раствор OneTaq для GC-богатых ампликонов. В случае, если >65% GC, рекомендуется OneTaq для GC-богатых ампликонов, с добавкой 10–20% OneTaq Enhancer для образцов с высоким содержанием GС .

Основные буферные растворы для эндонуклеаз рестрикции от New England Biolabs

К каждой эндонуклеазы рестрикции поставляется один из 4 буферных растворов, помеченный каждый своим цветом, чтобы обеспечить максимальную активность фермента. Случается, что некоторые ферменты требуют специфические условия, таком случае поставляется специальный буфер. В таблице вы сможете найти, какой буфер и при какой температуре будет находиться в оптимальных условиях.

Для удобства пользователей, БСА был включен во все буферные растворы от NEB для рестриктаз, и не требует дополнительного добавления.

Вот здесь представлено сравнение химического состава основных буферных растворов от New England Biolabs. Это NEBBuffer 2, NEBBuffer 2.1, NEBBuffer 3, NEBBuffer 3.1 и CutSmart Buffer.

Как видно, использование ограниченного числа буферных растворов позволяет экономить время, и проводить разрезание образца ДНК несколькими рестриктазами не последовательно, теряя время на очистку продуктов, а в одной реакционной смеси. Вот тут представлен удобный инструмент, каким образом подобрать рестриктазы, чтобы они были совместимы в одном буферном растворе.

В то же время, можно упросить задачу подборки ферментов, если помнить, что все высокоточные (HF) рестриктазы активны в одном буферном растворе CutSmart.

Активность эндонуклеаз рестрикции в реакционных растворах ДНК-полимераз Q5®, Taq и Phusion

Часто случается, что ПЦР-продукт после амплификации должен подвергнуться действию эндонуклеаз рестрикции. Для удобства пользователей, на сегодняшний день существует возможность разрезать образец ДНК при помощи эндонуклеаз рестрикции сразу после ПЦР реакции, без очистки реакционной смеси. В таблице представлена степень активности (в процентах) эндонуклеаз в ПЦР реакционных смесях.

Например, высокоточная рестриктаза BamHI-HF® на 100% активна в ПЦР-смеси полимеразы Taq (как в стандартном буфере, так и полимеразы LongAmp.

При составлении данной таблицы, 5 е.а. рестриктазы инкубировали в течение 1 часа при оптимальной температуре, в ПЦР-смеси, содержащей 1 мкг ДНК и 1 е.а. ДНК-полимеразы в 50 мкл реакционной смеси с концентрацией соответствующего буферного раствора 1X, и добавленными dNTPs (200 µM). Активность ферментов проверяли при помощи электрофореза.

Следует, однако, иметь в виду, что полимераза остается активной и может изменять концы фрагментов ДНК после их разрезания, вызывая последующее лигирование. Праймеры, содержащие сайты узнавания могут ингибировать процесс разрезания, а использование рестриктаз в условиях не абсолютно оптимальных может вызвать увеличение звездчатой активности. Если наблюдались серьезные отклонения результатов, рекомендуется очистить ДНК. Также, в некоторых случаях добавление х1 буферного раствора самой рестриктазы позволяет зачастую улучить качество результатов.

CutSmart буфер

Как уже было упомянуто выше, в ряду буферных растворов для рестриктаз от NEB появился буфер CutSmart, позволяющий проводить реакции со всеми HF ферментами в одном растворе.Более чем 200 рестриктаз сегодня на 100% активны в данном буферном растворе. Также множесто ДНК-модифицирующих ферментов на 100% активны в данном буфере, и таким образом, избавляют от дополнительного этапа очистки при комбинировании реакций.

Активность ДНК-модифицирующих ферментов в CutSmart буферном растворе

В таблице показана активность таких ферментов в CutSmart буферном растворе. Таким образом, видно, что щелочная фосфатаза, Т4 ДНК-лигаза, Т4 полинуклеотидкиназа и многие другие прекрасно комбинируются с СutSmart буфером.

Буферы для разбавления рестриктаз перед их использованием в реакции

Специально для разбавления рестриктаз перед использованием их в реакции, представлены буферы для разбавления A, B и C. Мы рекомендуем разбавлять ферменты непосредственно перед использованием, до концентрации по крайней мере 1,000 е.а./мл. Таблица соответствия буферов для разбавления рестриктазам представлена здесь. Следует иметь в виду, что при комбинации разрезания с термофильными полимеразами следует использовать другие растворы для разбавления.