Реактивы, оборудование и
расходные материалы
для лабораторий
0

#56 Универсальная готовая смесь Luna® для количественной ПЦР

20.08.2018

Все, кто когда-либо имел дело с количественной ПЦР, при планировании эксперимента сталкивались с трудной задачей выбора подходящих реагентов из огромного ассортимента продукции, представленной на рынке.

При подборе набора приходится учитывать следующие факторы: High ROX/Low ROX/no ROX как характеристика амплификатора, +dUTP/-dUTP, быстрое/стандартное нагревание, мультиплекс/единичная пара праймеров. Если добавить еще сюда специальные наборы для разных узких задач, а также то, что исходным материалом может быть ДНК/РНК и процесс может идти с использованием/без использования зондов – можете себе представить, какой сложный выбор стоял перед исследователями.

Именно поэтому я с таким недоверием отнеслась к информации, что можно выбрать один из 4 наборов LUNA от New England Biolabs и они будут совместимы с любыми образцами и с любыми амплификаторами. Если вы приняли решение работать с наборами LUNA – вам всего-навсего необходимо выбрать из 4 наборов: 2 набора для ДНК в качестве исходного материала и 2 набора – если ваш исходный материал – РНК.

1.jpg
Рисунок 1

В итоге – вы можете хранить в холодильнике всего 4 набора, и иметь возможность работать со всеми модификациями протокола количественной ПЦР.

Рисунок 2
Рисунок 2

Соответственно, набор #M3003 можно использовать для количественной ПЦР без зондов для образцов геномной ДНК и кДНК. Базой готовой смеси будет являться Hot Start Taq ДНК-полимераза и краситель SYBR® Green который интеркалирует с двухцепочечной ДНК. Набор #M3004 для тех, кто использует для количественной ДНК зонды типа TaqMan® и также в качестве исходного материала имеет геномную ДНК и кДНК.

Если в качестве исходного материала используется РНК, мы рекомендуем использовать набор #E3005 (без зондов), и #E3006 (с зондами). Принцип работы этих готовых смесей в том, что в одной смеси содержится как ДНК-полимераза, так и обратная транскриптаза - чтобы провести процесс обратной транскрипции и далее этап количественной ПЦР в одной смеси.

Количественная ПЦР (qPCR) позволяет в реальном времени оценивать эффективность процесса амплификации в каждом цикле при помощи измерения флуоресцентного сигнала. Большое количество подходов было использовано для генерации флуоресцентного сигнала – самые популярные из которых – это гидролизующиеся зонды (типа TaqMan®), или краситель, связывающийся с двухцепочечной ДНК (в данном случае SYBR® Green). В тот момент когда флуоресцентный сигнал детектируется на фоне базового сигнала, количественный цикл или  значение Cq, может быть определено. Значение Cq может быть использовано для определения относительного количества таргетного образца по сравнению с серией стандартов, которые были разбавлены из образца, концентрация которого заранее известна. qПЦР рутинно используется для детекции мутаций, генотипирования и молекулярной диагностики.

Модификацией количественной ПЦР является изменение протокола, чтобы детектировать и оценить количество РНК в образце. В таком случае сначала производится реакция обратной транскрипции, и далее кДНК используется для количественной ПЦР. В данном случае реакцию обратной транскрипции можно проводить как в той же реакционной смеси что ПЦР, или можно предварительно провести реакцию обратной транскрипции и далее в другой реакционной смеси ПЦР. Обычно для задач молекулярной диагностики используют подход в один этап. Также его используют, когда количество образца лимитировано. Двухстадийный подход более удобен тем, что полученную после 1 этапа кДНК можно хранить в течение длительного времени.

Оба подхода и реагенты, доступные для их реализации представлены на рисунках ниже. 

3.jpg
Рисунок 3  

4.jpg
Рисунок 4

Одним из преимуществ реагентов из линейки LUNA также является то, что готовая смесь окрашена, и вы легко сможете различить лунки, куда готовая смесь была раскапана и куда не была раскапана.

5.jpg
Рисунок 5

Если у вас возникнут вопросы по реагентам из линейки LUNA или вы решите разместить первый заказ со скидкой 15%, обращайтесь в вашему менеджеру по продажам или по электронной почте info@skygen.com.

Обратная связь

© 2012-2019 SkyGen
Информация и цены на сайте не являются публичной офертой
На нашем веб-сайте мы используем файлы cookie, которые помогают нам создать максимально удобные для посетителя условия пользования сайтом. Если Вы продолжите использовать сайт, мы будем считать что Вас это устраивает.
ОK