Подготовка качественной ДНК-библиотеки играет важную роль в секвенировании следующего поколения (NGS). Первым основным этапом NGS-пробоподготовки является фрагментация. В этом обзоре мы расскажем о 5 способах фрагментации ДНК, их особенностях, преимуществах и недостатках.
Все технологии NGS можно объединить одной характеристикой – это секвенирование коротких ридов, поэтому на входе должны быть фрагменты ДНК определенного размера, в зависимости от платформы секвенирования (обычно 300 – 600 п.о.). Это ставит перед исследователями задачу: как именно порезать выделенную геномную ДНК на кусочки заданного размера.
Существует три группы методов, к которым прибегают учёные для решения этой задачи:
Методы физической фрагментации используют физические силы для разрыва ковалентных связей в молекулах ДНК. Когда обе нити разрываются, ДНК фрагментируется на более мелкие кусочки. Соответственно, для создания таких физических сил используют соникацию/акустическую фрагментацию и небулизацию.
Соникация, или обработка ультразвуком, позволяет генерировать ультразвуковые волны, которые и разрушают ковалентные связи в ДНК, причем разрывы вносятся произвольным образом. Различная интенсивность и продолжительности обработки позволяют получить фрагменты желаемой длины. Для выполнения этой задачи потребуется специальный прибор – соникатор.
Соникаторы бывают двух видов – прямого и непрямого воздействия. Соникаторы прямого действия погружаются в образец и воздействуют на него изнутри, а при использовании соникаторов непрямого действия, образцы в пробирках помещаются в водяную баню внутри прибора.
Для молекулярно-биологических задач лучше подходят соникаторы непрямого действия, поскольку они более приспособлены к работе с образцами малого объема, также они не вспенивают и не нагревают образец, а фактор кросс-контаминации здесь отсутствует.
Для пробоподготовки ДНК-библиотек отлично подойдет соникатор Bioruptor® Pico (Diagenode), он позволяет получить фрагменты размером от 150 до 1000 п.о. Благодаря широкому выбору расходных материалов, возможна обработка различных объемов биоматериала (диапазон от 20 мкл до 2 мл) в количестве до 16 проб за один запуск прибора.
Встроенная система охлаждения (Bioruptor® Cooler) обеспечивает высокоточный контроль температуры, что предотвращает перегрев и агрегацию образцов. Прибор оснащен удобным интерфейсом, в котором как предустановлены стандартные протоколы обработки, так и реализована возможность тонкой настройки параметров под конкретные задачи. Подробная информация по использованию прибора представлена в
инструкции.
Сравнение параметров соникатора Bioruptor, соникатора конкурента и погружных соникаторов:
При небулизации используется сжатый газ, который проталкивает образец через пору определенного диаметра, что приводит к фрагментации ДНК. Таким способом можно получить фрагменты длиной от 100 до 3000 п.о, однако он приводит к серьезным потерям исходного материала и используется редко.
Ферментативная фрагментация использует особые ферменты, которые режут ДНК – эндонуклеазы. Здесь существует два метода: использование неспецифичных ДНКаз или тагментация.
Как правило, для обычной ферментативной фрагментации используются ферменты ДНКаза I и фрагментаза. Они неспецифично связываются с последовательностями ДНК и вносят разрез на расстоянии до 8 нуклеотидов от сайта связывания. Достичь нужной длины фрагментов ДНК можно, изменяя время инкубации с эндонуклеазами: чем дольше время инкубации – тем меньше фрагменты будут получены.
Тагментация – это метод ферментативной фрагментации при помощи транспозазы. Транспозаза одновременно разрезает ДНК и присоединяет к фрагментам адаптеры c обеих сторон. Дальнейший этап ПЦР использует эти адаптеры как праймеры, чтобы амплифицировать фрагменты ДНК и добавить больше адаптеров.
Основное преимущество тагментации заключается в том, что этапы фрагментации и лигирования адаптеров объединены в одну реакцию. Однако, для этого метода необходим этап ПЦР, что может вызвать некоторые ошибки, связанные с амплификацией. Исследователи могут использовать в работе готовые наборы для пробоподготовки библиотек методом тагментации или раствор транспозаз с адаптерами для Illumina или без них.
Метод химической фрагментации относительно прост и доступен, для него используются гидроксильные радикалы, возникающие в ходе реакции: Fe2+(EDTA4−) + H2O2 →Fe3+(EDTA4−) + OH•. Они нарушают стэкинг-взаимодействия в молекулах ДНК и приводят к разрывам молекулы из-за вторичных реакций. Однако, радикалы также могут повреждать нуклеотидные остатки на концах разрезов, что может затруднять дальнейшее присоединение адаптеров.
Шведские учёные провели сравнение всех трёх методов фрагментации, отсеквенировав геном фага лямбда [3]. На графике выше видно, что все методы фрагментации показывают схожие данные, которые также коррелируют с GC-составом.
Есть ещё один метод химической фрагментации, но он чаще используется для образцов РНК. Для такого эксперимента используют катионы двухвалентных металлов, таких как магний или цинк, совместно с нагреванием образца. Чем больше время инкубации – тем меньше фрагменты можно получить.
Мы рассмотрели 5 способов фрагментации ДНК, но какой именно использовать – решать только вам! У каждого метода есть свои преимущества и недостатки, теперь поговорим о них поподробнее.
Параметр | Физическая фрагментация | Ферментативная фрагментация | Химическая фрагментация |
Позволяет получить фрагменты заданной длины | да | да | да |
Нужно оборудование | да | нет | нет |
Нужны реагенты | нет | да | да |
Производительность | зависит от прибора | да | да |
Скорость | зависит от производительности | да | да |
Требования к исходному образцу | низкие | высокие | низкие |
Физическая фрагментация более толерантна к качеству исходного образца и позволяет получить более гомогенную по размеру фрагментов библиотеку, а также вносит разрывы более рандомно относительно ферментативной фрагментации. Однако, для физической фрагментации потребуется оборудование. Ферментативный и химический методы фрагментации более доступны из-за отсутствия необходимости приобретать оборудование, однако нужно будет заказывать реагенты. Также ферментативный метод может резать ДНК не совсем произвольно, и может отличаться воспроизводимость экспериментов, если используются разные смеси ферментов. Однако, для некоторых видов экспериментов эти нюансы не столь критичны. Химический способ фрагментации относительно прост и более доступен, однако может потребоваться дополнительная репарация концов фрагментов для более эффективного присоединения адаптеров.
Если удалось выбрать желаемый способ фрагментации, то можно сразу сузить спектр подходящих наборов для пробоподготовки ДНК-библиотек:
Наборы на основе физической фрагментации
Набор VAHTS Universal DNA для создания библиотек ДНК (
Illumina,
MGI)
Набор VAHTS® Universal Pro DNA для создания библиотек ДНК (Illumina, MGI)
Набор VAHTS® Universal DNA V2 для создания библиотек ДНК (Ion Torrent)
Характеристики:
- Высокая эффективность лигирования адаптеров, меньше потери при создании библиотек;
- Удобные мастермиксы снижают вероятность ошибок;
- От 100 пг до 4 мкг: широкий диапазон исходной ДНК;
- Подходит для работы с фрагментированной ДНК, сцДНК, FFPE образцов, ChIP ДНК и ампликонов.
Наборы на основе ферментативной фрагментации
Набор VAHTS Universal Plus DNA для создания библиотек ДНК (
Illumina, MGI)
Характеристики:
- От 100 пг до 1 мкг: широкий диапазон исходной ДНК;
- Применение: полногеномное, метагеномное секвенирование, совместим с панелями для таргетного секвенирования.
Набор VAHTS® Universal Plus V2 DNA для создания библиотек ДНК (
Illumina,
MGI)
Характеристики:
- Снижено количество химерных прочтений;
- Более надежное определение вариаций (SNV, InDel, SV).
Наборы на основе тагментации Для платформы
Illumina наборы представлены в четырех вариантах, которые подходят для работы с разными диапазонами исходной ДНК (500 нг, 50 нг, 5 нг и 1 нг).
Набор для платформы
MGI позволяет работать с исходной ДНК в количестве 100 пг - 500 нг.
Выбор реагентов большой, однако мы сможем предложить идеальное решение для любой задачи!
Отправьте свою заявку на sales@skygen.com и наши специалисты подберут подходящие реагенты и оборудование.