#45 Решения таргетного секвенирования от компании Nimagen

Геном человека суммарно содержит около 3 миллиардов пар нуклеотидов, и включает 20 800 генов и более 200 000 экзонов, доля которых составляет порядка 1 – 3%. В среднем на один ген приходится 9 экзонов размером по 170 п.н. Исследование генов и экзонов является важным и эффективным инструментом в клинической диагностике и популяционных научных исследованиях.

Секвенирование нового поколения (NGS) позволяет детектировать мутации даже в нескольких клетках, и помогает определять различные изменения в последовательности ДНК (SNP, инсерции, делеции, CNV). NGS также может быть инструментом для анализа экспрессии того или иного гена и использоваться для количественного измерения уровня мРНК, микроРНК и факторов, влияющих на это, например, метилирование промоторных областей. Поэтому, эта технология активно используется для анализа нарушений в ДНК при клинических исследованиях, постановке диагноза и подборе лечения.

К сожалению, проведение такого анализа, как полногеномное секвенирование или секвенирование транскриптома, не самая удобная технология для применения в клинике, поскольку это долго, дорого, а интерпретация такого большого количества данных может вызывать определённые трудности. Однако, поскольку очень многие мутации, вызывающие заболевания, уже известны, то области секвенирования можно сократить до нескольких экзонов генов, ассоциированных с интересующей болезнью.

Для секвенирования последовательности целевого гена используется подход таргетного секвенирования, что повышает продуктивность лабораторий и позволяет обнаруживать патологии с большей достоверностью. Таргетное секвенирование требует обогащения интересующей области, и для этого существует несколько подходов: ПЦР, твердофазная или жидкостная гибридизация, а также селективная циркуляризация.

Мы рады представить вам новую линейку наборов EasySeq™ от наших голландских партнеров из компании NimaGen, разработанную специально для подготовки образцов к таргетному секвенированию. В основе технологии этих наборов лежит система smMIP (single molecule Molecular Inversion Probe), позволяющая произвести обогащение целевого участка методом селективной циркуляризации. Этот метод прост, имеет высокую специфичность и позволяет проводить обогащение большого количества участков одновременно.

Принцип действия

В состав наборов входят оцДНК зонды smMIP, которые на обоих концах содержат области, комплементарные фланкирующим последовательностям интересующего гена. Также зонды содержат молекулярную метку и участки-праймеры для ПЦР (см. Рис.1).

Рис. 1. Строение зонда smMIP.

1. Гибридизация зонда smMIP на целевом участке (захват), последующий синтез комплементарной последовательности и лигирование.
   
2. Обработка экзонуклеазами и удаление всех не кольцевых молекул.
   
3. Амплификация с праймерами, содержащими адаптеры Illumina и баркоды.
   
4. Библиотека для секвенирования на платформе Illumina готова.
   
   

Наборы содержат всё необходимое для обогащения, захвата и последующей подготовки образцов для секвенирования. Полученные библиотеки EasySeq™ совместимы со всеми платформами Illumina.

Метод обогащения интересующих участков на основе smMIP в сочетании с простым протоколом обеспечивает ряд уникальных функций:

• Зонды smMIP для наборов EasySeq™ производит компания Biolegio с использованием запатентованного дизайна дочерней компании NimaGen:
  • Минимальное смешение во время амплификации;
  • Отсутствует необходимость в разработке собственных последовательностей праймеров.
• Не требуется фрагментация ДНК: образец ДНК наносят в предварительно аликвотированную смесь, содержащую сбалансированный пул зондов smMIP, а после запускают протокол захвата.
• Анализ каждой молекулы: благодаря уникальным молекулярным меткам в каждой молекуле система генерирует консенсусы захвата оригинальных молекул. Это помогает обнаруживать низкочастотные мутации и исключать ошибки секвенирования, а также позволяет детектировать вариации числа копий в геноме (CNV).
• Зонды с двумя специфичными участками: поскольку в основе технологии захвата целевых областей лежит гибридизация с двумя участками зонда, исследователи получают более специфичные результаты и могут исключить ошибки секвенирования, вызванные формалином, для образцов полученных из FFPE-блоков.