#41 Visium – пространственная транскриптомика

Планирование эксперимента

Измеряйте и визуализируйте активность генов, сочетая преимущества традиционной гистологии с возможностями анализа полного транскриптома. 

Пространственная транскриптомика — это новаторский метод молекулярного профилирования, который позволяет ученым измерять активность генов в образце ткани и отображать ее локализацию. Пространственная экспрессия генов определяет экспрессию генов путем сопоставления всего транскриптома с морфологическим контекстом во всех фиксированных в формалине парафинизированных образцах (FFPE) или свежезамороженных (FF) тканях, чтобы открыть новые возможности для понимания развития, патологии заболеваний и клинических трансляционных исследований.

Рисунок 1. Получите пространственную характеристику экспрессии генов и белков с высоким разрешением с помощью платформы Visium. Откройте для себя новые биомаркеры, изучив гистологию, белки и мРНК из одного и того же участка ткани. Исследуйте пространственные взаимоинтеграции между клетками в нормальной и пораженной ткани. Комбинируйте с иммунофлуоресценцией (IF) для совместного обнаружения поверхностных белков или с окрашиванием гематоксилином и эозином (H&E) для исследования морфологического контекста.

Перед началом экспериментов по пространственной транскриптомике мы рекомендуем вам рассмотреть следующие вопросы, которые помогут спланировать эксперимент и определить, как достичь ваших исследовательских целей:

1. Какова цель моего исследования? 
2. Какую ткань я буду исследовать? 
3. Свежезамороженная ткань: Каковы наилучшие методы подготовки и обработки моих образцов? 
4. FFPE: Каковы наилучшие методы подготовки и обработки моих образцов? 
5. Как мне анализировать и визуализировать свои данные? 
6. На какие примеры использования я могу ориентироваться? 
7. Как мне подготовить свою лабораторию?

1. Какова цель вашего исследования?

• Профилирование клеток: характеризуйте, идентифицируйте и каталогизируйте ткани, сохраняя при этом их расположение в пространстве.
• Открытие биомаркеров: идентифицируйте новые биомаркеры и генные сигнатуры клеточных процессов и течения болезни.
• Сравнительные исследования: изучите различия между нормальной и пораженной тканью.
• Пространственно-временной анализ: отслеживайте популяции клеток и закономерности экспрессии генов с течением времени и ход прогрессирования заболевания.

2. Какую ткань вы будете исследовать

При проведении анализа Visium используются различные химические методы захвата генов. В ходе анализа свежезамороженной ткани используется захват поли(А) для подготовки библиотеки полного транскриптома, в то время как анализ FFPE образцов происходит путем гибридизации зондов ДНК на матрице РНК для высокоспецифичного и чувствительного обнаружения полного транскриптома. 

Внутри компании технология пространственной экспрессии генов Visium была успешно протестирована на более чем 30 различных свежезамороженных тканях различных видов. В настоящее время пространственная экспрессия генов Visium для образцов FFPE совместима с множеством различных тканей человека и мыши.

Рисунок 2. Совместимость тканей с пространственной экспрессией генов Visium. Выбор протокола Visium зависит от того, какие образцы тканей вам доступны. В настоящее время анализ FFPE совместим с тканями человека и мыши. Свежезамороженный анализ был протестирован на людях, мышах, крысах и рыбках данио, и может быть применен к другим видам. Анализ свежезамороженной ткани также совместим с предварительно разработанными таргетными панелями 10X Genomics, позволяющими сосредоточиться на генах, наиболее важных для вашего исследования. Профилирование полного транскриптома может быть выполнено как на свежезамороженных образцах тканей, так и на образцах тканей FFPE.

3. Свежезамороженная ткань: Каковы наилучшие методы подготовки и обработки ваших образцов?

• Подготовка образцов: оптимизация и размещение тканей. Поскольку каждый образец ткани уникален, крайне важно оптимизировать условия проницаемости для свежезамороженных образцов с помощью эксперимента по пространственной оптимизации тканей Visium. Крайне важно, чтобы срезы тканей размещались на предметном стекле Visium таким образом, чтобы они покрывали области захвата, но не выходили за вспомогательные рамки. Настоятельно рекомендуется практиковать размещение на простых предметных стеклах. Несмотря на возможность сбросить неправильно размещенные слайды, это может привести к небольшому снижению чувствительности по сравнению с новым слайдом. 
• Подготовка образца: качество РНК. Получение высококачественных данных секвенирования в значительной степени зависит от качества транскриптов мРНК, полученных из срезов вашей ткани. Для свежезамороженных тканей рекомендуется RIN ≈7. 
• Окрашивание/визуализация. Срезы ткани могут быть окрашены гематоксилином и эозином (H&E) для морфологического анализа или окрашены флуоресцентно мечеными антителами для совместного обнаружения поверхностных белков. Успешная визуализация в значительной степени зависит от надлежащей практики получения изображения на микроскопе и использования совместимых реагентов. 
• Подготовка библиотеки: характеристики секвенирования. Для библиотек, полученных из свежезамороженных тканей, рекомендуемая глубина секвенирования составляет 50 000 прочтений.

4. FFPE: Каковы наилучшие методы подготовки и обработки ваших образцов?

• Подготовка образца: качество РНК. Получение высококачественных данных секвенирования в значительной степени зависит от качества транскриптов мРНК, полученных из срезов ткани. RIN не определяет успешность секвенирования в тканях FFPE, поэтому рекомендуется проверять блоки на DV200, процент фрагментов РНК > 200 нуклеотидов. Рекомендуются блоки с DV200 ≈50%. 
• Подготовка образца: адгезия и размещение ткани. Адгезия тканей FFPE к поверхности слайдов с пространственной экспрессией генов Visium может отличаться от других анализов на основе тканей. Факторы, влияющие на адгезию, включают фиксацию и встраивание, тип ткани, секционирование и размещение секций. Тестовый слайд с разрезом ткани Visium можно использовать для проверки блоков FFPE на предмет их адгезионных свойств на предметных стеклах Visium. 
• Депарафинизация + окрашивание\визуализация. Срезы ткани могут быть окрашены гематоксилин-эозином для морфологического анализа или окрашены флуоресцентно мечеными антителами для определения экспрессии поверхностных белков. 
• Подготовка библиотеки: характеристики секвенирования. Для библиотек, созданных из тканей FFPE, минимальная глубина секвенирования составляет 25 000 чтений и достаточна для большинства образцов.

5. Как вам анализировать и визуализировать свои данные?

В ходе проведения протокола Visium фиксируются два основных типа данных: изображение ткани, окрашенной гематоксилин-эозином или окрашенной с помощью антител, и данные последовательности в формате FASTQ. В начале данные обрабатываются с помощью программного обеспечения - Space Ranger. Затем результаты можно интерактивно изучить с помощью программного обеспечения для визуализации - Loupe. На сайте компании предоставляются образцы наборов данных, которые позволят вам ознакомиться с Space Ranger и браузером Loupe до начала собственных экспериментов по экспрессии пространственных генов Visium. 

Space Ranger представляет собой набор аналитических наборов команд, которые выполняют демультиплексирование образцов, выравнивание изображений, обработку баркодов и подсчет генов с использованием данных пространственного секвенирования Visium и изображений микроскопа. Затем программа присваивает каждому обнаруженному транскрипту гена пространственное местоположение на изображении ткани на основе соответствующего пространственного баркода.

Loupe Browser - это программное обеспечение, которое предоставляет функции интерактивной визуализации для анализа данных. Для Visium Spatial это позволяет пользователям исследовать значимые гены, характеризовать и уточнять кластеры, а также выполнять анализ дифференциальной экспрессии.

Рисунок 3. Visium анализ данных. Во время протокола Visium фиксируются два основных типа данных: изображение ткани и файлы FASTQ, содержащие данные секвенирования библиотеки экспрессии генов. Программное обеспечение для анализа Space Ranger автоматически накладывает информацию о пространственной экспрессии генов на изображение вашей ткани и идентифицирует с аналогичными профилями транскрипции. Затем вы можете использовать программное обеспечение для визуализации - Loupe для интерактивного изучения результатов.

6. Примеры использования

7. Как подготовить лабораторию?

В таблице ниже приводится краткое описание основного оборудования и реагентов для обработки тканей. Для получения полного списка, пожалуйста, обратитесь к протоколам для пространственной экспрессии и пространственной экспрессии генов Visium для FFPE.