#34 Анализ 5’-экспрессии генов и иммунопрофилирование на уровне единичных клеток. Готовое решение от 10x Genomics для изучения COVID-19.

Продолжающаяся вспышка коронавирусной инфекции (COVID-19) унесла тысячи жизней, и случаи заражения растут с каждым днем. Ускорение нашего понимания адаптивного и врожденного иммунного ответа на инфекционные заболевания имеет решающее значение, ведь эти исследования могут лечь в основу разработки эффективных стратегий вакцинации.

Анализ экспрессии генов на уровне единичных клеток помогает изучить биологию заболевания, процессы, происходящие в организме после инфицирования, и реакцию иммунной системы.

Иммунопрофилирование от 10x Genomics позволяет:

• Изучить клеточное разнообразие адаптивного и врождённого иммунитета;
• Идентифицировать и охарактеризовать редкие типы клеток и биомаркеры;
• Анализировать микроокружение тканей, течение заболевания и ответ на лечение;
• Исследовать антитела и Т-клеточные рецепторы для новых антигенов;
• Охарактеризовать иммунный ответ, измеряя представленность клонов и фенотипы иммунных клеток.

Для решения этих задач компания 10x Genomics разработала протокол 5’-экспрессии генов, позволяющий проанализировать V(D)J-профили Т- и B-клеток в исходном образце. Для данного анализа потребуются чипы (Рис.1) и гелевые частицы для процессинга живых клеток, и, конечно, прибор Chromium Controller.

Технология

В основе технологии лежит объединение клеток с гелевыми частицами в индивидуальные эмульсионные капли и дальнейшая подготовка библиотек для секвенирования.

Объединение клеток с гелевыми частицами

В качестве исходного образца используется суспензия живых клеток в буферном растворе (PBS или аналогичный, сохраняющий жизнеспособность клеток). Она помещается на чип, который, в свою очередь, процессируется в приборе.

Рис.1. Чип G для процессинга клеток в рамках анализа 5’-экспрессии генов.

В микроканалах чипа живые клетки из суспензии, проходя через масляный барьер, распределяются по индивидуальным эмульсионным каплям с гелевыми частицами (Gel Bead-in-Emulsion, GEM) (Рис.2, Рис.3).

Рис.2. Схема структуры олигонуклеотидов, закрепленных на гелевой частице для анализа 5’-экспрессии генов. Они несут адаптер R1 для Illumina, 10x баркод для баркодирования клетки, UMI для удаления ПЦР-дубликатов транскриптов, а также инвертирующий праймер TSO, захватывающий транскрипт с 5’-конца.

Рис.3. Процесс объединения гелевых частиц и клеток в индивидуальные эмульсионные капли. Каждая такая капля будет содержать: гелевую частицу с олигонуклеотидами, несущими баркоды, живую клетку, реагенты для лизиса клетки и обратной транскрипции.

Внутри каждой капли клетки и гелевые частицы лизируются. Клеточные мРНК захватываются за поли-А хвост, и происходит присоединение праймера для инверсии цепи. Цепь-инвертирующий праймер отжигается на комплементарную последовательность олигонуклеотида гелевой частицы, захватывая таким образом мРНК с 5’-конца (Рис.4).

Рис.4. Схема построения первой цепи и закрепления цепь-инвертрирующего праймера. Процесс происходит внутри каждой эмульсионной капли с гелевой частицей и клеткой. После очистки на магнитных частицах полученная кДНК амплифицируется.

Из полученного образца можно сделать два типа библиотек для секвенирования. Первый вариант – тотальная библиотека 5’-экспрессии генов, а второй – библиотека только V(D)J-регионов. Для второго варианта используется специальный набор праймеров от 10x Genomics, которые позволяют амплифицировать V(D)J-регионы Т- и В-клеток человека и мыши. В итоге в обоих случаях пользователь получает готовые библиотеки, совместимые с любым прибором Illumina.

Рис.5. Схема амплификации V(D)J-регионов T- и B-клеток и общий вид финальной библиотеки.

Также можно выбрать сразу оба варианта, разделив исходный образец на 2 пробирки, и выполнять протоколы параллельно.

Глубина прочтения библиотек:

• 5’-экспрессии – 20 000 пар ридов/клетку
• V(D)J-регионов – 5 000 пар ридов/клетку

Обработка данных секвенирования осуществляется при помощи бесплатного программного обеспечением от 10x Genomics: Cell Ranger (первичная обработка данных), Loupe V(D)J Browser (вторичная обработка, визуализация, поиск клонотипов и др.).

Области применения

Данная технология активно применяется для изучения иммунного ответа на коронавирусную инфекцию, а исследования клеточной гетерогенности и репертуаров антител на уровне единичных клеток позволяют выявить наиболее уязвимые клеточные популяции.

Примеры исследований, проведенных при помощи технологии 10x Genomics:

• Выявление высокой воспалительной активности макрофагов FCN1 в пробах жидкости бронхоальвиолярного лаважа у пациентов с обширным поражением легких и повышенной клональности CD8 T-клеток у пациентов с легкой формой инфекции методом иммунопрофилирования на уровне единичных клеток.
  The landscape of lung bronchoalveolar immune cells in COVID-19 revealed by single-cell RNA sequencing. Liao et al., 2020.
• Определение преобладающей экспрессии ACE2 в секреторных клетках транзиторной зоны бронхов с помощью секвенирования РНК на уровне единичных клеток. Данный тип клеток наиболее подвержен поражению инфекцией SARS-CoV-2.
  SARS-CoV-2 receptor ACE2 and TMPRSS2 are predominantly expressed in a transient secretory cell type in subsegmental bronchial branches. Lukassen et al., 2020
• Профилирование фенотипов клеток PMBC у четырёх пациентов до, во время и после интенсивной терапии выявило экспрессионную сигнатуру вирусного поражения ткани и ответа интерферонами 1 типа при тяжелом поражении инфекцией SARS-CoV-2.
  Viral Invasion and Type I Interferon Response Characterize the Immunophenotypes during COVID-19 Infection. Wei et al., 2020

Полный список публикаций доступен по ссылке.