#28 Петлевая изотермическая амплификация ДНК и РНК (LAMP и RT-LAMP): решения New England Biolabs

Долгое время основным методом амплификации нуклеиновых кислот оставалась полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако современные подходы к молекулярной диагностике (например, point-of-care) требуют более простых, быстрых и дешевых способов получения результатов, чем ПЦР.

В связи с этим был разработан целый ряд методов изотермической амплификации нуклеиновых кислот. И самым популярным из них на сегодняшний день является петлевая изотермическая амплификация ДНК и РНК (LAMP и RT-LAMP).

Из этого обзора вы узнаете:

✔ Принципы методов LAMP и RT-LAMP
✔ Способы детекции продуктов LAMP/RT-LAMP
✔ Преимущества LAMP/RT-LAMP перед ПЦР для молекулярной диагностики
✔ Продукция New England Biolabs для LAMP/RT-LAMP
✔ Примеры использования продукции NEB для LAMP/RT-LAMP (в т.ч. SARS-CoV-2)
✔ Список литературы

Принцип методов LAMP и RT-LAMP

Оригинальный протокол метода LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) был предложен японскими учеными 20 лет¹ назад. Он заключался в использовании для амплификации ДНК четырех олигонуклеотидных праймеров и большого фрагмента Bst ДНК-полимеразы, обладающего сильной вытесняющей активностью.

Четыре праймера должны быть специфичны к 6 участкам целевого фрагмента:
F3 – прямой наружный праймер, комплементарный участку F3c, B3 – обратный наружный праймер, комплементарный участку B3c, FIP – прямой внутренний праймер состоит из двух частей: F1c (5’) и F2 (3’), комплементарных участкам F1 и F2c, соответственно, BIP – обратный внутренний праймер состоит из двух частей: B1c (5’) и B2 (3’), комплементарных участкам B1 и B2c, соответственно.

Процесс амплификации методом LAMP можно разделить на три основных этапа: 1) образование базовой гантелеобразной структуры, 2) этап циклической амплификации, 3) этап элонгации и повторения циклов.

Подробную схему можно увидеть в оригинальной статье¹. Мы же предлагаем вам посмотреть короткую анимацию от специалистов New England Biolabs, дающую общее представление о принципе LAMP:

В результате такой реакции образуется множество конкатемеров инвертированных повторов целевого фрагмента, формирующих в пространстве структуры, похожие на цветную капусту (cauliflower-like structures). И если длина участка-мишени обычно составляет 80-250 н.п., то длина конкатемеров может достигать 20 т.п.н. и больше.

Чуть позже авторы метода предложили его усовершенствованную модификацию, предполагающую использование уже 6 праймеров, специфичных к 8 участкам целевого фрагмента. Еще два петлевых праймера LoopF и LoopB должны быть комплементарны последовательностям между участками F1 и F2, а также B1 и B2 фрагмента-мишени. Они вступают в игру на третьем этапе реакции, отжигаясь на одноцепочечных участках образовавшихся ранее петель ДНК и становясь дополнительными центрами инициации полимеризации.

Также разработчики LAMP показали, что в качестве матрицы можно использовать и РНК, если добавить в реакционную смесь обратную транскриптазу. Такой вариант метода называется RT-LAMP (reverse transcription-coupled LAMP). Позднее компания New England Biolabs разработала версию 3.0 Bst ДНК-полимеразы, обладающую ревертазной активностью и исключающую необходимость использования в реакции еще одного фермента (см. ниже).

Пожалуй, самой сложной частью дизайна LAMP-эксперимента является подбор праймеров. И даже встречаются рекомендации тестировать не один комплект из 4-6 олигонуклеотидов. К счастью, уже разработаны специальные программы для автоматического подбора праймеров для LAMP/RT-LAMP.

Одна из самых популярных программ подобного рода PrimerExplorer доступна онлайн по адресу http://primerexplorer.jp/e/. На этом же ресурсе можно скачать руководство с требованиями к LAMP-праймерам.

Другой полезный инструмент - веб-сервис MorphoCatcher²⁵, являющийся плагином к программе PrimerExplorer (http://morphocatcher.ru/). Он позволяет использовать для дизайна праймеров множественное выравнивание ортологичных генов и помещать видоспецифичные нуклеотидные полиморфизмы на концах праймеров, что существенно увеличивает их специфичность.

Разработка тест-систем на основе LAMP предполагает не только дизайн праймеров, но и определение их оптимальных концентраций. Кроме того, необходимо подобрать концентрацию ионов магния, температуру реакции, подходящий буфер.

Иногда эффективность и специфичность реакции могут повысить дополнительные компоненты, например, L-пролин или Tte UvrD ДНК-геликаза. А для борьбы с контаминацией вследствие переноса можно использовать систему дУТФ/УДГ (см. ниже).

Способы детекции продуктов LAMP/RT-LAMP

Как правило, единственное, что хочет узнать исследователь, поставивший реакцию LAMP, - присутствовала ли целевая последовательность в исходном образце (например, ДНК/РНК патогена). Чтобы ответить на этот вопрос достаточно установить, накопились ли продукты в смеси в ходе реакции.

Конечно, можно воспользоваться классическим методом агарозного гель-электрофореза. Поскольку в ходе LAMP образуются ДНК-конкатемеры кратной длины, то при их разделении в геле формируется лестница бэндов. Дорожки с отрицательными результатами или отрицательными контролями остаются пустыми (Рис. 3, СЛЕВА). Однако этот способ относительно трудоемок и времязатратен.

Гораздо проще по завершении LAMP окрасить реакционную смесь интеркалирующим красителем (SYBR Green, бромистый этидий, пропидиум йодид, PicoGreen и др.) и посмотреть на нее в УФ свете (Рис. 3, ПО ЦЕНТРУ). Более того, следить за изменением флуоресценции окрашенной реакционной смеси можно прямо в ходе процесса с помощью реал-тайм амплификатора или специального реал-тайм флуориметра для LAMP (Рис. 3, СПРАВА).

Некоторые исследователи используют для реал-тайм LAMP/RT-LAMP не красители, а различные варианты FIP или BIP флуоресцентных зондов. В частности, для мультиплексной реал-тайм LAMP/RT-LAMP были предложены FIP/BIP DARQ-зонды³ (Рис. 4).

Также о результатах LAMP/RT-LAMP можно судить по косвенным признакам. Например, в ходе полимеризации ДНК активно образуется побочный продукт реакции – пирофосфат. При его взаимодействии с ионами магния в реакционной смеси образуется нерастворимая соль, замутняющая раствор. Если реакция идет достаточно долго, то это помутнение можно увидеть даже невооруженным глазом. Но для быстрой детекции продуктов по мутности рекомендуется использовать реал-тайм турбидиметр (Рис. 5).

Другими побочными продуктами, которые накапливаются в большом количестве, являются протоны. И если используемый буфер обладает не очень большой емкостью, pH раствора может заметно сдвинуться в кислую сторону.

Этот эффект лег в основу колориметрического метода детекции продуктов LAMP с помощью pH-чувствительных красителей (например, фенолового, крезолового или нейтрального красного). Будучи добавленными в реакционную смесь, они меняют свой цвет в ходе реакции (см. ниже).

О других методах детекции продуктов LAMP вы можете узнать из статьи Becherer et al.⁴

Преимущества LAMP/RT-LAMP перед ПЦР для молекулярной диагностики

В таблице ниже мы сравнили методы LAMP и ПЦР по основным характеристикам, имеющим значение для современной молекулярной диагностики.

*При использовании Bst 3.0 ДНК-полимеразы от NEB

Для эффективной LAMP-амплификации достаточно меньше 10 копий целевого участка в исходной реакционной смеси. И иногда из-за меньшей чувствительности к примесям и ингибиторам в качестве образца можно использовать даже грубые лизаты и биологические жидкости.

Продукция New England Biolabs для LAMP/RT-LAMP

В качестве продуктов для LAMP/RT-LAMP New England Biolabs предлагает различные версии Bst ДНК-полимеразы с буферами, готовые наборы, а также вспомогательные компоненты для увеличения специфичности и борьбы с контаминацией.

Bst ДНК-полимераза, большой фрагмент (арт. M0275 L/S/M)

Каталог →

Представляет собой фрагмент ДНК-полимеразы Bacillus stearothermophilus с молекулярной массой 67 кДа. Активности фермента: 5´→3´ полимеразная, 5´→3´ вытесняющая, слабая ревертазная. Именно этот реагент использовали японские исследователи при разработке метода LAMP¹.

Bst 2.0 ДНК-полимераза (арт. M0537 L/S/M)

Каталог →

Эта разработанная in silico, усовершенствованная версия Bst ДНК-полимеразы характеризуется повышенной скоростью амплификации и увеличенным выходом реакции. Также фермент отличается большей термостабильностью и толерантностью к концентрации соли, что обеспечивает гибкость условий реакции.

Bst 2.0 WarmStart® ДНК-полимераза (арт. M0538 L/S/M)

Каталог →

Представляет собой вариант Bst 2.0 ДНК-полимеразы, который при температуре ниже 45°C нековалентно связан с аптамером, ингибирующем его активность. Это позволяет готовить реакционную смесь при комнатной температуре, не опасаясь преждевременного начала полимеризации.

Bst 3.0 ДНК-полимераза (арт. M0374 L/S/M)

Каталог →

Представляет собой еще более усовершенствованную версию Bst ДНК-полимеразы. Помимо всех преимуществ Bst 2.0 ДНК-полимеразы фермент обладает сильной ревертазной активностью вплоть до температуры 72°C. Это позволяет ставить реакцию RT-LAMP без добавления обратной транскриптазы.

Таблица сравнения различных версий Bst ДНК-полимеразы New England Biolabs

Набор для петлевой изотермической WarmStart® амплификации ДНК и РНК (арт. E1700 L/S)

Каталог →

Набор включает в себя готовую реакционную смесь для LAMP и RT-LAMP. Всё, что вам нужно будет в нее добавить, – матрицу, смесь праймеров и воду. Набор совместим с различными методами детекции. В комплект поставки входит флуоресцентый краситель для измерения флуоресценции продуктов в режиме реального времени.

Готовая смесь для колориметрической петлевой изотермической WarmStart® амплификации ДНК и РНК (арт. M1800 L/S)

Каталог →

Готовая смесь содержит Bst 2.0 WarmStart® ДНК-полимеразу, WarmStart® RTx обратную транскриптазу, буфер с низкой емкостью, дНТФ и pH-чувствительный краситель. Детекция продуктов осуществляется колоримерическим методом: смеси, в которых накапливается продукт, в ходе реакции меняют свой цвет с красного на желтый.

WarmStart® RTx обратная транскриптаза (арт. M0380 L/S)

Каталог →

Эта ревертаза была специально разработана для RT-LAMP, хотя ее можно использовать и для обычного синтеза кДНК. Одно из достоинств фермента – отсутствие активности при комнатной температуре.

Tte UvrD ДНК-геликаза (арт. M1202 S)

Каталог →

Эта термостабильная геликаза из бактерий Thermoanaerobacter tengcongensi способна расплетать широкий спектр дцДНК-субстраторв. При добавлении в реакционную LAMP/RT-LAMP-смесь она может существенно повышать специфичность амплификации.

Антарктическая термолабильная урацил-ДНК-гликозилаза (арт. M0372 L/S)

Каталог →

Поскольку LAMP/RT-LAMP – это очень чувствительный метод, то вероятность контаминации смеси продуктами предыдущих реакций для него еще больше, чем для ПЦР. И это нужно учитывать при организации рабочего пространства и дизайне эксперимента.

Помимо стандартных мер предосторожности, одним из способов борьбы с контаминацией вследствие переноса является добавление в реакционную смесь дУТФ и предварительная обработка реакционных смесей антарктической термолабильной урацил-ДНК-гликозилазой.

Она высвободит урацил из продуктов предыдущих LAMP, если те попали в новую реакционную смесь. Во время основной реакции этот термолабильный фермент уже будет неактивен, а фрагменты ДНК с абазическими сайтами претерпят гидролитическое расщепление.

Также для LAMP/RT-LAMP вам могут понадобиться

Примеры использования продукции New England Biolabs для LAMP/RT-LAMP

Список литературы

Раскрыть ↓

1. Notomi T. et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000. 28: E63. DOI: 10.1093/nar/28.12.e63.
2. Tomita N. et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat Protoc. 2008. 3: 877-882. DOI: 10.1038/nprot.2008.57.
3. Tanner N.A. et al. Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification. Biotechniques. 2012. 53: 81-89. DOI: 10.2144/0000113902.
4. Becherer L. et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) – review and classification of methods for sequence-specific detection. Anal. Methods. 2020. 12: 717-746. DOI: 10.1039/C9AY02246E.
5. Li W. et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification for the Detection of Xanthomonas arboricola pv. pruni in Peaches. Plant Pathol J. 2019. 35: 635-643. DOI: 10.5423/PPJ.OA.07.2019.0197.
6. Takano C. et al. Development of a Novel Loop-Mediated Isothermal Amplification Method to Detect Guiana Extended-Spectrum (GES) β-Lactamase Genes in Pseudomonas aeruginosa. Front Microbiol. 2019. 10: 25. DOI: 10.3389/fmicb.2019.00025.
7. Beissner M. et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification for Laboratory Confirmation of Buruli Ulcer Disease-Towards a Point-of-Care Test. PLoS Negl Trop Dis. 2015. 9: e0004219. DOI: 10.1371/journal.pntd.0004219.
8. Srisawat M. and Panbangred W. Efficient and Specific Detection of Salmonella in Food Samples Using a stn-Based Loop-Mediated Isothermal Amplification Method. Biomed Res Int. 2015. 2015: 356401. DOI: 10.1155/2015/356401.
9. Nemoto M. et al. Rapid detection of equine coronavirus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. J Virol Methods. 2015. 215-216:13-6. DOI: 10.1016/j.jviromet.2015.02.001.
10. Bhadra S. et al. Real-time sequence-validated loop-mediated isothermal amplification assays for detection of Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV). PLoS One. 2015. 10: e0123126. DOI: 10.1371/journal.pone.0123126.
11. Bhadra S. et al. Simultaneous Detection of Different Zika Virus Lineages via Molecular Computation in a Point-of-Care Assay. Viruses. 2018. 10: 714. DOI: 10.3390/v10120714.
12. Rodríguez-García Á. rt al. DNA Extraction with DNAzol and LAMP, Performed in a Heating Block as a Simple Procedure for Detection of Mycobacterium tuberculosis in Sputum Specimens. Methods Protoc. 2018. 1: 37. DOI: 10.3390/mps1040037.
13. Fernández-Soto P. et al. Detection of Schistosoma mansoni-derived DNA in human urine samples by loop-mediated isothermal amplification (LAMP). PLoS One. 2019. 14: e0214125. DOI: 10.1371/journal.pone.0214125.
14. Stedtfeld R.D. et al. Direct loop mediated isothermal amplification on filters for quantification of Dehalobacter in groundwater. J Microbiol Methods. 2016. 131:61-67. DOI: 10.1016/j.mimet.2016.09.025.
15. Sriworarat C. et al. Development of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for simple detection of Leishmania infection. Parasit Vectors. 2015. 8: 591. DOI: 10.1186/s13071-015-1202-x.
16. Noden B.H. et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for rapid screening of ticks and fleas for spotted fever group rickettsia. PLoS One. 2018. 13: e0192331. DOI: 10.1371/journal.pone.0192331.
17. Silva S.J.R. et al. Development and Validation of Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) for Rapid Detection of ZIKV in Mosquito Samples from Brazil. Sci Rep. 2019. 9: 4494. DOI: 10.1038/s41598-019-40960-5.
18. Njiru Z.K. et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification Test for Trypanosoma gambiense Group 1 with Stem Primers: A Molecular Xenomonitoring Test for Sleeping Sickness. J Trop Med. 2017. 2017: 8630708. DOI: 10.1155/2017/8630708.
19. Lin X. et al. Fast and Parallel Detection of Four Ebola Virus Species on a Microfluidic-Chip-Based Portable Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification System. Micromachines (Basel). 2019. 10: E777. DOI: 10.3390/mi10110777.
20. Grandjean Lapierre S. and Drancourt M. rpoB Targeted Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Consensus Detection of Mycobacteria Associated With Pulmonary Infections. Front Med (Lausanne). 2018. 5: 332. DOI: 10.3389/fmed.2018.00332.
21. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.02.26.20028373v1
22. Ahn S.J. et al. Rapid and simple colorimetric detection of multiple influenza viruses infecting humans using a reverse transcriptional loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) diagnostic platform. BMC Infect Dis. 2019. 19: 676. DOI: 10.1186/s12879-019-4277-8.
23. Hayashida K. et al. Field diagnosis and genotyping of chikungunya virus using a dried reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay and MinION sequencing. PLoS Negl Trop Dis. 2019. 13: e0007480. DOI: 10.1371/journal.pntd.0007480.
24. Mohon A.N. et al. Ultrasensitive loop mediated isothermal amplification (US-LAMP) to detect malaria for elimination. Malar J. 2019. 18: 350. DOI: 10.1186/s12936-019-2979-4.
25. Shirshikov F.V. et al. MorphoCatcher: a multiple-alignment based web tool for target selection and designing taxon-specific primers in the loop-mediated isothermal amplification method. PeerJ. 2019. 7: e6801. doi: 10.7717/peerj.6801.