Реактивы, оборудование и
расходные материалы
для лабораторий
English version
пн-пт: 9:30-18:00 по МСК
0

#28 Изотермическая амплификация: решения от New England Biolabs

30.09.2015

Что такое изотермическая амплификация и чем она отличается от ПЦР? ПЦР - это широко известный подход к амплификации специфических ДНК последовательностей. ПЦР включает в себя повторяющуюся циклическое изменение температуры реакционного коктейля.

Альтернативный подход к амплификации специфического образца ДНК не требуют изменения температуры реакционной смеси, и поэтому часто его называют изотермической амплификацией. такие протоколы варьируются, каждый из них имеет свои преимущества. В целом, проведение изотермической амплификации требует намного меньше времени и не требует амплификатора, что делает методику особенно удобной для применения в поле, и во время приема пациента.

Преимущества методики:

  • Быстрый протокол
  • Минимальное количество требуемого оборудования
  • Надежное проведения реакции в присутствии ингибиторов полимеризации
  • Простая оптическая детекция прохождения реакции
  • Давайте рассмотрим, какие основные продукты от New England Biolabs могут быть использованы для реализации этой методики.

    1. ДНК-полимераза Bst 3.0

    Bst 3.0 - это последняя новинка для проведения изотермической амплификации измененный in silico гомолог большого фрагмента ДНК-полимеразы I, выделенной из Bacillus stearothermophilis, который был изменен для улучшения качеств при проведении реакции изотермической амплификации и улучшения активности фермента как обратной транскриптазы. Bst 3.0 обладает 5'-3' ДНК-полимеразной активностью, используя как матрицу как ДНК, так и РНК, и также может сама расплетать цепи нуклеиновых кислот. В то же время фермент не обладает 5'-3' и 3'-5' экзонуклеазной активностью. Bst 3.0 демонстрирует надежное проведение реакции и характеризуется значительно увеличенной активностью как обратная транскриптаза, по сравнению с Bst ДНК-полимеразой.

    Если вы не уверены, какой продукт лучше всего подойдет для вашего эксперимента, воспользуйтесь таблицей ниже!

    Таблица 1. Сравнения свойств ДНК-полимераз для изотермической амплификации.

    Артикул Название Применение Активность
    как обратной
    транскриптазы
    5'-3' экзонуклеазная
    активность
    Толерантность
    к ингибитору
    Скорость
    амплификации
    M0328S/L Bst, полная длина Реакция "смещения разрыва" при повышенных температурах нет да низкая низкая
    M0275S/L Bst, большой фрагмент Реакции с расплетанием цепи; самая распространенная полимераза для LAMP, и других типов диагностической амплификации низкая нет низкая низкая
    M0537S/M/L Bst 2.0 Улучшенный протокол LAMP, SDA, и другие типы амплификации средняя нет средняя средняя
    M0538S/M/L Bst 2.0 WarmStart Реакции, использующие большое количества проб, с возможностью составления реакционной смеси при комнатной температуре средняя нет средняя средняя
    M0374S/L/M Bst 3.0 Наиболее надежная LAMP, RT-LAMP. Высокая активность как обратной транскриптазы до 72С. высокая нет высокая высокая

    В приведенной таблице, упоминаются некоторые типы изотермической амплификации, давайте рассмотрим подробнее некоторые методик, в числе которых будут методики LAMP&RT-LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) и SDA (Strand Displacement Amplification).

    2. LAMP&RT-LAMP (петлевая изотермическая амплификация & петлевая изотермическая амплификация, совмещенная с обратной транскрипцией).

    ISO1.png

    Рис.1.: Схема прохождения LAMP.

    На рисунке 1, мы можем видеть схему проведения эксперимента при реализации петлевой изотермической амплификации. LAMP была создана для детекции таргентых нуклеиновых кислот без использования сложного оборудования. В протоколе используется 4-6 праймеров, которые направлены на распознание 4-6 определенных регионов таргетной ДНК. ДНК-полимераза, которая обладает способностью к расплетанию цепей, инициирует синтез, и два праймера формируют петлеобразную структуру для облегчения последующие раунды амплификации. LAMP обеспечивает высокую чувствительность (фетаграммы или <10 копий таргетного участка), реакции могут быть проведены за время, которое меньше чем 5-10 минут. Дополнительно, реакции могут быть проведены с использованием лимитированных ресурсов (в т.ч. при помощи водной бани для инкубирования и детекции результатов на глаз), или с real-time измерениями и инструментами с высокопропускной способностью.

    Детекция таргетных участков РНК выполняется с помощью простого добавления обратной транскриптазы к реакции LAM (в том числе обратная транскриптаза WarmStart RTx), таким образом реакция RT-LAMP проводится в один этап, при этом в изотермических условиях.

    3.Амплификация со смещением цепи (SDA)

    Вторым типом изотермической амплификации, который мы хотим обсудить - это SDA, в основе которой лежит ДНК-полимераза, которая способна к расплетанию цепей. Обычно это большой фрагмент Bst ДНК-полимеразы, или фрагмент Кленова (3'-5' exo), для инициации полимеризации в местах разрывов, созданных эндонуклеазой рестрикции или никирующим ферментом (в том числе Nt. BstNBI, NEB #R0607) на последовательности, которая содержится в праймере. Участок, который подвергается разрезанию, регенерируется с каждым этапом полимеризации и смещения, в результате происходит экспоненциальная амплификация. SDA - обычно используется в клинической диагностике.

    Кроме рассмотренных двух типов протоколов, существует также еще менее распространенные методики.

    3. Амплификация с использованием хеликаз (HDA)

    iso2.png

    Рис.2.:Схема прохождения амплификации с использованием хеликаз.

    Методика использует способность ферментов-хеликаз разделять цепи ДНК, что позволяет праймеру прикрепиться к поверхности, и далее происходит удлинение цепи при помощи ДНК-полимеразы, которая также способна к разделению цепей. Как и ПЦР этот протокол позволяет использовать два праймера. HDA была использована в диагностических приборах и тестах. В портфолио New England Biolabs методика представлена набором для изотермической амплификации IsoAmp.

    Мы надеемся, что данный обзор поможет Вам в дальнейшей работе!

    Обратная связь

    © 2012-2019 SkyGen
    Информация и цены на сайте не являются публичной офертой
    На нашем веб-сайте мы используем файлы cookie, которые помогают нам создать максимально удобные для посетителя условия пользования сайтом. Если Вы продолжите использовать сайт, мы будем считать что Вас это устраивает.
    ОK