Долгое время основным методом амплификации нуклеиновых кислот оставалась полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако современные подходы к молекулярной диагностике (например, point-of-care) требуют более простых, быстрых и дешевых способов получения результатов, чем ПЦР.
В связи с этим был разработан целый ряд методов изотермической амплификации нуклеиновых кислот. И самым популярным из них на сегодняшний день является петлевая изотермическая амплификация ДНК и РНК (LAMP и RT-LAMP).
Из этого обзора вы узнаете:
✔ Принципы методов LAMP и RT-LAMP
✔ Способы детекции продуктов LAMP/RT-LAMP
✔ Преимущества LAMP/RT-LAMP перед ПЦР для молекулярной диагностики
✔ Продукция New England Biolabs для LAMP/RT-LAMP
✔ Примеры использования продукции NEB для LAMP/RT-LAMP (в т.ч. SARS-CoV-2)
✔ Список литературы
Оригинальный протокол метода LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) был предложен японскими учеными 20 лет1 назад. Он заключался в использовании для амплификации ДНК четырех олигонуклеотидных праймеров и большого фрагмента Bst ДНК-полимеразы, обладающего сильной вытесняющей активностью.
![]() |
Рис. 1. Строение праймеров для LAMP2.
|
Четыре праймера должны быть специфичны к 6 участкам целевого фрагмента:
F3 – прямой наружный праймер, комплементарный участку F3c, B3 – обратный наружный праймер, комплементарный участку B3c, FIP – прямой внутренний праймер состоит из двух частей: F1c (5’) и F2 (3’), комплементарных участкам F1 и F2c, соответственно, BIP – обратный внутренний праймер состоит из двух частей: B1c (5’) и B2 (3’), комплементарных участкам B1 и B2c, соответственно.
Процесс амплификации методом LAMP можно разделить на три основных этапа: 1) образование базовой гантелеобразной структуры, 2) этап циклической амплификации, 3) этап элонгации и повторения циклов.
Подробную схему можно увидеть в оригинальной статье1. Мы же предлагаем вам посмотреть короткую анимацию от специалистов New England Biolabs, дающую общее представление о принципе LAMP:
В результате такой реакции образуется множество конкатемеров инвертированных повторов целевого фрагмента, формирующих в пространстве структуры, похожие на цветную капусту (cauliflower-like structures). И если длина участка-мишени обычно составляет 80-250 н.п., то длина конкатемеров может достигать 20 т.п.н. и больше.
Чуть позже авторы метода предложили его усовершенствованную модификацию, предполагающую использование уже 6 праймеров, специфичных к 8 участкам целевого фрагмента. Еще два петлевых праймера LoopF и LoopB должны быть комплементарны последовательностям между участками F1 и F2, а также B1 и B2 фрагмента-мишени. Они вступают в игру на третьем этапе реакции, отжигаясь на одноцепочечных участках образовавшихся ранее петель ДНК и становясь дополнительными центрами инициации полимеризации.
![]() |
Рис. 2. Усовершенствованный метод LAMP с использованием петлевых праймеров.
|
Также разработчики LAMP показали, что в качестве матрицы можно использовать и РНК, если добавить в реакционную смесь обратную транскриптазу. Такой вариант метода называется RT-LAMP (reverse transcription-coupled LAMP). Позднее компания New England Biolabs разработала версию 3.0 Bst ДНК-полимеразы, обладающую ревертазной активностью и исключающую необходимость использования в реакции еще одного фермента (см. ниже).
Пожалуй, самой сложной частью дизайна LAMP-эксперимента является подбор праймеров. И даже встречаются рекомендации тестировать не один комплект из 4-6 олигонуклеотидов. К счастью, уже разработаны специальные программы для автоматического подбора праймеров для LAMP/RT-LAMP.
Одна из самых популярных программ подобного рода PrimerExplorer доступна онлайн по адресу http://primerexplorer.jp/e/. На этом же ресурсе можно скачать руководство с требованиями к LAMP-праймерам.
Другой полезный инструмент - веб-сервис MorphoCatcher25, являющийся плагином к программе PrimerExplorer (http://morphocatcher.ru/). Он позволяет использовать для дизайна праймеров множественное выравнивание ортологичных генов и помещать видоспецифичные нуклеотидные полиморфизмы на концах праймеров, что существенно увеличивает их специфичность.
Разработка тест-систем на основе LAMP предполагает не только дизайн праймеров, но и определение их оптимальных концентраций. Кроме того, необходимо подобрать концентрацию ионов магния, температуру реакции, подходящий буфер.
Иногда эффективность и специфичность реакции могут повысить дополнительные компоненты, например, L-пролин или Tte UvrD ДНК-геликаза. А для борьбы с контаминацией вследствие переноса можно использовать систему дУТФ/УДГ (см. ниже).
Как правило, единственное, что хочет узнать исследователь, поставивший реакцию LAMP, - присутствовала ли целевая последовательность в исходном образце (например, ДНК/РНК патогена). Чтобы ответить на этот вопрос достаточно установить, накопились ли продукты в смеси в ходе реакции.
Конечно, можно воспользоваться классическим методом агарозного гель-электрофореза. Поскольку в ходе LAMP образуются ДНК-конкатемеры кратной длины, то при их разделении в геле формируется лестница бэндов. Дорожки с отрицательными результатами или отрицательными контролями остаются пустыми (Рис. 3, СЛЕВА). Однако этот способ относительно трудоемок и времязатратен.
![]() |
Рис. 3. Способы детекции продуктов реакции LAMP/RT-LAMP: СЛЕВА – агарозный гель-электрофорез с окраской бромистым этидием, ПО ЦЕНТРУ – окраска реакционной смеси интеркалирующим красителем, СПРАВА – измерение флуоресценции реакционной смеси, окрашенной интеркалирующим красителем, в режиме реального времени.
|
Гораздо проще по завершении LAMP окрасить реакционную смесь интеркалирующим красителем (SYBR Green, бромистый этидий, пропидиум йодид, PicoGreen и др.) и посмотреть на нее в УФ свете (Рис. 3, ПО ЦЕНТРУ). Более того, следить за изменением флуоресценции окрашенной реакционной смеси можно прямо в ходе процесса с помощью реал-тайм амплификатора или специального реал-тайм флуориметра для LAMP (Рис. 3, СПРАВА).
Некоторые исследователи используют для реал-тайм LAMP/RT-LAMP не красители, а различные варианты FIP или BIP флуоресцентных зондов. В частности, для мультиплексной реал-тайм LAMP/RT-LAMP были предложены FIP/BIP DARQ-зонды3 (Рис. 4).
![]() |
Рис. 4. СЛЕВА – строение FIP DARQ-зонда (Q – quencher, F – fluorophore), СПРАВА – результаты мультиплексной реал-тайм LAMP с использованием DARQ-зондов.
|
Также о результатах LAMP/RT-LAMP можно судить по косвенным признакам. Например, в ходе полимеризации ДНК активно образуется побочный продукт реакции – пирофосфат. При его взаимодействии с ионами магния в реакционной смеси образуется нерастворимая соль, замутняющая раствор. Если реакция идет достаточно долго, то это помутнение можно увидеть даже невооруженным глазом. Но для быстрой детекции продуктов по мутности рекомендуется использовать реал-тайм турбидиметр (Рис. 5).
![]() |
Рис. 5. Анализ результатов LAMP по мутности реакционной смеси: СЛЕВА – показания реал-тайм турбидиметра, СПРАВА – визуальная детекция.
|
Другими побочными продуктами, которые накапливаются в большом количестве, являются протоны. И если используемый буфер обладает не очень большой емкостью, pH раствора может заметно сдвинуться в кислую сторону.
Этот эффект лег в основу колориметрического метода детекции продуктов LAMP с помощью pH-чувствительных красителей (например, фенолового, крезолового или нейтрального красного). Будучи добавленными в реакционную смесь, они меняют свой цвет в ходе реакции (см. ниже).
О других методах детекции продуктов LAMP вы можете узнать из статьи Becherer et al.4
В таблице ниже мы сравнили методы LAMP и ПЦР по основным характеристикам, имеющим значение для современной молекулярной диагностики.
Характеристика | ПЦР | LAMP |
Предварительный этап денатурации ДНК | Необходим | Не нужен |
Температурный режим | Требует термоциклирования | Изотермический (обычно 65°C) |
Специфичность | Средняя (2 праймера) | Высокая (4-6 праймеров) |
Чувствительность к примесям |
Высокая Как правило, требуется выделение НК |
Более низкая Выделение НК требуется не всегда |
Степень амплификации | 109 раз (30 циклов) | 109-1010 раз |
Время реакции | 45 мин - > 3 ч | 5 – 60 мин |
Приборы | Дорогой амплификатор | Недорогой термоблок, термостат или водяная баня |
РНК-матрица | Предварительный этап обратной транскрипции, дополнительный фермент обязателен | Обратная транскрипция при той же температуре, дополнительный фермент необязателен* |
Визуальные методы детекции | Нет | Есть |
*При использовании Bst 3.0 ДНК-полимеразы от NEB
Для эффективной LAMP-амплификации достаточно меньше 10 копий целевого участка в исходной реакционной смеси. И иногда из-за меньшей чувствительности к примесям и ингибиторам в качестве образца можно использовать даже грубые лизаты и биологические жидкости.
В качестве продуктов для LAMP/RT-LAMP New England Biolabs предлагает различные версии Bst ДНК-полимеразы с буферами, готовые наборы, а также вспомогательные компоненты для увеличения специфичности и борьбы с контаминацией.
Представляет собой фрагмент ДНК-полимеразы Bacillus stearothermophilus с молекулярной массой 67 кДа. Активности фермента: 5´→3´ полимеразная, 5´→3´ вытесняющая, слабая ревертазная. Именно этот реагент использовали японские исследователи при разработке метода LAMP1.
Эта разработанная in silico, усовершенствованная версия Bst ДНК-полимеразы характеризуется повышенной скоростью амплификации и увеличенным выходом реакции. Также фермент отличается большей термостабильностью и толерантностью к концентрации соли, что обеспечивает гибкость условий реакции.
![]() |
Рис. 6. СЛЕВА – Зависимость активности различных версий Bst ДНК-полимераз от концентрации солей в реакционной смеси, СПРАВА – сравнение скорости LAMP-реакций, катализируемых различными Bst ДНК-полимеразами.
|
Представляет собой вариант Bst 2.0 ДНК-полимеразы, который при температуре ниже 45°C нековалентно связан с аптамером, ингибирующем его активность. Это позволяет готовить реакционную смесь при комнатной температуре, не опасаясь преждевременного начала полимеризации.
![]() |
Рис. 7. Результаты LAMP-реакций, катализируемых Bst 2.0 и Bst 2.0 WarmStart® ДНК-полимеразами. Сплошные линии – инкубацию при 65°C начинали сразу после сбора реакционной смеси, штриховые линии – перед инкубацией при 65°C реакционную смесь выдерживали в течение 2 ч при температуре 25°C.
|
Представляет собой еще более усовершенствованную версию Bst ДНК-полимеразы. Помимо всех преимуществ Bst 2.0 ДНК-полимеразы фермент обладает сильной ревертазной активностью вплоть до температуры 72°C. Это позволяет ставить реакцию RT-LAMP без добавления обратной транскриптазы.
Таблица сравнения различных версий Bst ДНК-полимеразы New England Biolabs
Фермент |
Скорость амплификации |
Подготовка реакционной смеси при комнатной температуре |
Ревертазная активность | Толерантность к ингибиторам |
Bst ДНК-полимераза, большой фрагмент |
★ |
нет | ★ | ★ |
Bst 2.0 ДНК-полимераза |
★★ | нет | ★★ | ★ |
Bst 2.0 WarmStart® ДНК-полимераза | ★★ | ★★★ | ★★ | ★★ |
Bst 3.0 ДНК-полимераза | ★★★ | ★★ | ★★★ | ★★★ |
Набор включает в себя готовую реакционную смесь для LAMP и RT-LAMP. Всё, что вам нужно будет в нее добавить, – матрицу, смесь праймеров и воду. Набор совместим с различными методами детекции. В комплект поставки входит флуоресцентый краситель для измерения флуоресценции продуктов в режиме реального времени.
Готовая смесь содержит Bst 2.0 WarmStart® ДНК-полимеразу, WarmStart® RTx обратную транскриптазу, буфер с низкой емкостью, дНТФ и pH-чувствительный краситель. Детекция продуктов осуществляется колоримерическим методом: смеси, в которых накапливается продукт, в ходе реакции меняют свой цвет с красного на желтый.
![]() |
Рис. 8. Колориметрический метод детекции продуктов LAMP/RT-LAMP.
|
Эта ревертаза была специально разработана для RT-LAMP, хотя ее можно использовать и для обычного синтеза кДНК. Одно из достоинств фермента – отсутствие активности при комнатной температуре.
![]() |
Рис. 9. СЛЕВА – зависимость активности WarmStart® RTx обратной транскриптазы от температуры, СПРАВА – пороговые значения времени RT-LAMP, проведенных с помощью Bst 2.0 ДНК-полимеразы и указанных ревертаз; A-G – различные сочетания целевых участков и праймеров.
|
Эта термостабильная геликаза из бактерий Thermoanaerobacter tengcongensi способна расплетать широкий спектр дцДНК-субстраторв. При добавлении в реакционную LAMP/RT-LAMP-смесь она может существенно повышать специфичность амплификации.
![]() |
Рис. 10. Влияние Tte UvrD ДНК-геликазы на специфичность LAMP. Реакцию LAMP ставили с помощью Набора для петлевой изотермической WarmStart® амплификации ДНК и РНК (арт. E1700) и набора праймеров, склонных давать положительный результат в контрольных смесях без матрицы (NTC). Без Tte UvrD ДНК-геликазы (СЛЕВА) амплификация в NTC начиналась через 20 мин. В присутствии 10 нг Tte UvrD ДНК-геликазы (СПРАВА) амплификация в NTC была полностью подавлена.
|
Поскольку LAMP/RT-LAMP – это очень чувствительный метод, то вероятность контаминации смеси продуктами предыдущих реакций для него еще больше, чем для ПЦР. И это нужно учитывать при организации рабочего пространства и дизайне эксперимента.
Помимо стандартных мер предосторожности, одним из способов борьбы с контаминацией вследствие переноса является добавление в реакционную смесь дУТФ и предварительная обработка реакционных смесей антарктической термолабильной урацил-ДНК-гликозилазой.
![]() |
Рис. 11. Принцип действия антарктической термолабильной урацил-ДНК-гликозилазы.
|
Она высвободит урацил из продуктов предыдущих LAMP, если те попали в новую реакционную смесь. Во время основной реакции этот термолабильный фермент уже будет неактивен, а фрагменты ДНК с абазическими сайтами претерпят гидролитическое расщепление.
Артикул | Наименование |
N0459 S | Раствор дУТФ (100 мМ, 25 мкмоль) |
N0446 S | Набор растворов дезоксинуклеотидов (дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ) (100 мМ, по 25 мкмоль) |
N0447 L/S |
Смесь дезоксинуклеотидов (дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ) (10 мМ, 40 мкмоль) Смесь дезоксинуклеотидов (дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ) (10 мМ, 8 мкмоль) |
B1500 L/S |
Вода без нуклеаз (4 x 25 мл) Вода без нуклеаз (25 мл) |
Продукт NEB |
Цель использования |
Источник |
Bst ДНК-полимераза, большой фрагмент | Детекция Xanthomonas arboricola pv. pruni у груш | 5 |
Детекция генов β-лактамазы GES-типа у Pseudomonas aeruginosa | 6 | |
Point-of-care диагностика язвы Бурули | 7 | |
Детекция сальмонеллы в образцах пищи | 8 | |
Детекция коронавируса ECoV у лошадей | 9 | |
Bst 2.0 ДНК-полимераза | Детекция коронавируса MERS-CoV у людей | 10 |
Point-of-care диагностика вируса Зика | 11 | |
Диагностика Mycobacterium tuberculosis в образцах мокроты | 12 | |
Bst 2.0 WarmStart® ДНК-полимераза | Детекция Schistosoma mansoni в образцах мочи человека | 13 |
Детекция бактерий Dehalobacter в грунтовых водах | 14 | |
Детекция лейшманий в клинических образцах (кровь, слюна, биоптаты) | 15 | |
Скрининг клещей и блох на инфицированность риккетсиями, вызывающими пятнистую лихорадку | 16 | |
Bst 3.0 ДНК-полимераза | Детекция вируса Зика у комаров | 17 |
Диагностика африканского трипаносомоза | 18 | |
Набор для петлевой изотермической WarmStart® амплификации ДНК и РНК | Детекция четырех видов эболавирусов | 19 |
Детекция микобактерий, ассоциированных с инфекционными заболеваниями легких |
20 | |
Готовая смесь для колориметрической петлевой изотермической WarmStart® амплификации ДНК и РНК | Детекция коронавируса SARS-CoV-2 (COVID-19) | 21 |
Детекция вирусов гриппа человека | 22 | |
WarmStart® RTx обратная транскриптаза | Детекция вируса Чикунгунья | 23 |
Диагностика малярии с использованием образцов цельной крови и сухих пятен крови | 24 |
Присоединяйтесь к нам в Telegram!
Вебинары
Новости
Oxford Nanopore Technologies объявили о сотрудничестве с 10x Genomics
Мы в соцсетях