#28 Изотермическая амплификация: решения от New England Biolabs
Что такое изотермическая амплификация и чем она отличается от ПЦР? ПЦР - это широко известный подход к амплификации специфических ДНК последовательностей. ПЦР включает в себя повторяющуюся циклическое изменение температуры реакционного коктейля.
Альтернативный подход к амплификации специфического образца ДНК не требуют изменения температуры реакционной смеси, и поэтому часто его называют изотермической амплификацией. такие протоколы варьируются, каждый из них имеет свои преимущества. В целом, проведение изотермической амплификации требует намного меньше времени и не требует амплификатора, что делает методику особенно удобной для применения в поле, и во время приема пациента.
Преимущества методики:
Давайте рассмотрим, какие основные продукты от New England Biolabs могут быть использованы для реализации этой методики.
1. ДНК-полимераза Bst 3.0
Bst 3.0 - это последняя новинка для проведения изотермической амплификации измененный in silico гомолог большого фрагмента ДНК-полимеразы I, выделенной из Bacillus stearothermophilis, который был изменен для улучшения качеств при проведении реакции изотермической амплификации и улучшения активности фермента как обратной транскриптазы. Bst 3.0 обладает 5'-3' ДНК-полимеразной активностью, используя как матрицу как ДНК, так и РНК, и также может сама расплетать цепи нуклеиновых кислот. В то же время фермент не обладает 5'-3' и 3'-5' экзонуклеазной активностью. Bst 3.0 демонстрирует надежное проведение реакции и характеризуется значительно увеличенной активностью как обратная транскриптаза, по сравнению с Bst ДНК-полимеразой.
Если вы не уверены, какой продукт лучше всего подойдет для вашего эксперимента, воспользуйтесь таблицей ниже!
Таблица 1. Сравнения свойств ДНК-полимераз для изотермической амплификации.
| Артикул | Название | Применение |
Активность как обратной транскриптазы |
5'-3' экзонуклеазная активность |
Толерантность к ингибитору |
Скорость амплификации |
| M0328S/L | Bst, полная длина | Реакция "смещения разрыва" при повышенных температурах | нет | да | низкая | низкая |
| M0275S/L | Bst, большой фрагмент | Реакции с расплетанием цепи; самая распространенная полимераза для LAMP, и других типов диагностической амплификации | низкая | нет | низкая | низкая |
| M0537S/M/L | Bst 2.0 | Улучшенный протокол LAMP, SDA, и другие типы амплификации | средняя | нет | средняя | средняя |
| M0538S/M/L | Bst 2.0 WarmStart | Реакции, использующие большое количества проб, с возможностью составления реакционной смеси при комнатной температуре | средняя | нет | средняя | средняя |
| M0374S/L/M | Bst 3.0 | Наиболее надежная LAMP, RT-LAMP. Высокая активность как обратной транскриптазы до 72С. | высокая | нет | высокая | высокая |
В приведенной таблице, упоминаются некоторые типы изотермической амплификации, давайте рассмотрим подробнее некоторые методик, в числе которых будут методики LAMP&RT-LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) и SDA (Strand Displacement Amplification).
2. LAMP&RT-LAMP (петлевая изотермическая амплификация & петлевая изотермическая амплификация, совмещенная с обратной транскрипцией).
Рис.1.: Схема прохождения LAMP.
На рисунке 1, мы можем видеть схему проведения эксперимента при реализации петлевой изотермической амплификации. LAMP была создана для детекции таргентых нуклеиновых кислот без использования сложного оборудования. В протоколе используется 4-6 праймеров, которые направлены на распознание 4-6 определенных регионов таргетной ДНК. ДНК-полимераза, которая обладает способностью к расплетанию цепей, инициирует синтез, и два праймера формируют петлеобразную структуру для облегчения последующие раунды амплификации. LAMP обеспечивает высокую чувствительность (фетаграммы или <10 копий таргетного участка), реакции могут быть проведены за время, которое меньше чем 5-10 минут. Дополнительно, реакции могут быть проведены с использованием лимитированных ресурсов (в т.ч. при помощи водной бани для инкубирования и детекции результатов на глаз), или с real-time измерениями и инструментами с высокопропускной способностью.
Детекция таргетных участков РНК выполняется с помощью простого добавления обратной транскриптазы к реакции LAM (в том числе обратная транскриптаза WarmStart RTx), таким образом реакция RT-LAMP проводится в один этап, при этом в изотермических условиях.
3.Амплификация со смещением цепи (SDA)
Вторым типом изотермической амплификации, который мы хотим обсудить - это SDA, в основе которой лежит ДНК-полимераза, которая способна к расплетанию цепей. Обычно это большой фрагмент Bst ДНК-полимеразы, или фрагмент Кленова (3'-5' exo), для инициации полимеризации в местах разрывов, созданных эндонуклеазой рестрикции или никирующим ферментом (в том числе Nt. BstNBI, NEB #R0607) на последовательности, которая содержится в праймере. Участок, который подвергается разрезанию, регенерируется с каждым этапом полимеризации и смещения, в результате происходит экспоненциальная амплификация. SDA - обычно используется в клинической диагностике.
Кроме рассмотренных двух типов протоколов, существует также еще менее распространенные методики.3. Амплификация с использованием хеликаз (HDA)
Рис.2.:Схема прохождения амплификации с использованием хеликаз.
Методика использует способность ферментов-хеликаз разделять цепи ДНК, что позволяет праймеру прикрепиться к поверхности, и далее происходит удлинение цепи при помощи ДНК-полимеразы, которая также способна к разделению цепей. Как и ПЦР этот протокол позволяет использовать два праймера. HDA была использована в диагностических приборах и тестах. В портфолио New England Biolabs методика представлена набором для изотермической амплификации IsoAmp.
Мы надеемся, что данный обзор поможет Вам в дальнейшей работе!