#26 Молекулярное клонирование

Итак, современный протокол молекулярного клонирования включает рестрикцию вектора и вставки, последующую очистку фрагментов и лигирование. 

Затем происходит трансформация в штамм компетентных клеток для амплификации плазмиды. Успешно трансформированные колонии отбираются путем высевания на селективной среде, а затем правильность вставки проверяется методом ПЦР или рестрикционным расщеплением плазмидной ДНК. 

Кроме того, для проверки целостности последовательности клонированного фрагмента нередко используют прямое секвенирование плазмиды.

Однако, способов подготовки вектора и целевого гена к вставке и их соединения существует несколько: традиционное клонирование, ПЦР клонирование, бесшовное клонирование, безлигазное клонирование и рекомбинантное клонирование.

Под термином «традиционное клонирование» обычно подразумевают методы, в которых для синтеза рекомбинантной плазмиды используют эндонуклеазы рестрикции и лигазы.

Вставку и вектор обрабатывают рестрикционными ферментами, чьи сайты узнавания фланкируют клонируемый участок и присутствуют в полилинкере вектора. Полилинкер или сайт множественного клонирования - это участок плазмиды, содержащий большое количество сайтов рестрикции. Необходимо подбирать сайты рестрикции, уникальные как для вставки, так и для вектора. 

При направленном клонировании используют две разные рестриктазы с соответствующими уникальными сайтами узнавания на концах вставки. 

В зависимости от типа фермента могут образовываться тупые или липкие концы ДНК. Проводить рестрикцию сразу двумя или более ферментами гораздо проще и быстрее, особенно, если все они максимально активны в одном и том же буфере.

New England Biolabs поставляет 286 эндонуклеаз рестрикции, из них 216 имеют 100% активность в буфере CutSmart. Кроме того, почти все из них имеют статус Time-Saver. Проводить модификацию концов ДНК в этом случае не обязательно. Однако, при ненаправленном клонировании рекомендуется дефосфорилировать вектор, для исключения самолигирования. 

Для объединения вектора и вставки в классическом протоколе принято использовать Т4 ДНК-лигазу. С её помощью можно провести реакцию лигирования за 2 часа при 25°С. Или сократить время реакции до 5 минут, воспользовавшись набором для быстрого лигирования от NEB.

Набор для сборки ДНК-конструкций BioBrick

Технология BioBrick была одной из первых попыток стандартизировать традиционное клонирование, а теперь она признана стандартом синтетической биологии.

Готовый набор подходит для сборки мультифрагментных вставок (две вставки и один вектор) методом рестрикции/лигирования и включает все необходимые ферменты и буферы. 

Схема эксперимента представлена на рисунке ниже:

Изначально процесс получения целевого участка ДНК был крайне длительным и трудоёмким, однако открытие метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 1980-х годах значительно расширило возможности молекулярного клонирования. С помощью ПЦР и вставка, и даже вектор могут быть полностью синтезированы без использования рестриктаз. ПЦР клонирование — это быстрый и высокопроизводительный метод, позволяющий копировать фрагменты ДНК, которые сложно выделить в большом количестве, а также когда полная последовательность фрагмента не известна заранее. 

В зависимости от свойств выбранной полимеразы, протокол может меняться. Если для амплификации используется Taq ДНК-полимераза, то благодаря нематричной активности фермента, на 3’- концах продуктов ПЦР добавляется по одному дополнительному остатку аденина. Затем такие вставки с «А-хвостами» лигируют с комплементарным вектором с «Т-хвостами» на концах, с помощью Т4 ДНК-лигазы. Такой метод называют A/T – клонирование. 

При использовании современных высокоточных полимераз, например, ДНК-полимеразы Q5 дополнительных нематричных хвостов не образуется. Фрагменты с тупыми концами присоединяются стандартным лигированием или с помощью «активированного» вектора – к нему ковалентно присоединен фермент, облегчающий образование комплекса вектор-вставка, как правило используют топоизомеразу I. 

Типичный недостаток ПЦР клонирования – необходимость использовать специализированные векторы. Обычно их необходимо приобретать дополнительно, например, NEB поставляет их уже в линеаризованном виде, готовом к использованию. Это также ограничивает исследователей в выборе генов устойчивости к антибиотикам, промоторов и других регуляторных элементов.

Набор для ПЦР-клонирования

Набор подходит для быстрого клонирования ампликонов, вне зависимости от вида выбранной полимеразы. При использовании набора нет необходимости очищать ПЦР-продукты перед лигированием. Для снижения количества колоний, не прошедших трансформацию разработан метод ПЦР-клонирования с векторами «самоубийцами», включающими так называемый «токсичный» ген. Если целевая последовательность корректно лигировалась, такой «токсичный» ген деактивируется и плазмида успешно амплифицируется после трансформации в клетки. 

Данный набор содержит готовую смесь ферментов для клонирования, линеаризованный вектор с «токсичным» геном, компетентные клетки и питательную среду для них.

Преимущества набора для ПЦР-клонирования:

• Простое клонирование всех ПЦР-продуктов, включая фрагменты с тупыми или T/A концами; 
• Быстрый протокол, лигирование всего за 5 минут; 
• Упрощённый процесс отбора колоний с плазмидами; 
• Не требуются этапы очистки; 
• Транскрипция in vitro возможно с SP6 или T7 промоторов; 
• В состав набора входят праймеры, позвояющие проводить ПЦР-скрининг колоний (colony PCR) или секвенирование; 
• Все необходимые компоненты входят в состав набора.

В 21 веке бурное развитие получило направление синтетической биологии. Методы молекулярного клонирования были усовершенствованы для создания сложных генетических конструкций с новыми заданными свойствами и не имеющих аналогов в природе. Появились новые высокопроизводительные технологии, такие как бесшовное клонирование, безлигазное и рекомбинантное клонирование и др.

Безлигазное клонирование (от англ. Ligation Independent Cloning, LIC) появилось в начале 1990-х годов. Суть метода заключается в линеаризации вектора рестриктазой и последующей обработкой ДНК-полимеразой Т4. 

Метод использует 3 ’-> 5’ экзоактивность этого фермента для создания липких концов длиной 11 - 14 оснований. Включение дГТФ в реакцию ограничивает процессинг до первого комплементарного остатка цитозина, затем полимеризационная и экзонуклеазная активности ДНК-полимеразы Т4 становятся «сбалансированными».

Вставку синтезируют с помощью ПЦР, причём праймеры подбираются так, чтобы концы фрагмента были комплементарны концам вектора. Достаточно смешать такой продукт с вектором и трансформировать смесью компетентные клетки бактерии, чтобы получить плазмиды с геном интересующего белка.

На соединенных фрагментах образуются 4 ника, которые восстанавливаются репарационными системами E.coli после трансформации. Таким образом, LIC позволяет избежать нескольких стадий рестрикции, выделения из геля и лигирования, каждая из которых может стать причиной неудачного клонирования.

Технология рекомбинантного клонирования построена на основе механизма интеграции фага λ. Она получила свое название от сайт-специфического фермента рекомбиназы, благодаря которому возможно направленно переносить фрагмент ДНК из одной векторной молекулы в другую. Cre-рекомбиназа взаимодействует только с идентичными LoxP-сайтами и осуществляет вырезки или инверсии ДНК между ними, поэтому этот метод особенно удобен, когда одну и ту же вставку необходимо переместить в разные векторы с сохранением рамки считывания.

Рекомбинантное клонирование стало полезным инструментом для поиска наиболее производительных линий при экспрессии белков и при создании репортерных векторов в функциональном анализе.

Преимущества рекомбинантного клонирования:

• Быстрый протокол клонирования; 
• Высокая эффективность; 
• Универсальность; 
• Воспроизводимость результатов.

«Швы» — это следы использования молекулярных систем клонирования. Например, в конечном продукте рекомбинантного клонирования целевые последовательности будут разделены дополнительными сайтами узнавания (LoxP). В сборке BioBrick между вставками будут оставаться участок кодирующий тирозин и стоп-кодон. «Бесшовные» методы клонирования, такие как сборка по Гибсону и технология GoldenGate, позволяют синтезировать множественные упорядоченные вставки внутри открытой рамки считывания, благодаря чему они получили широкое распространение в белковой инженерии.

Ставший классическим, метод сборки ДНК-конструкций по Гибсону позволяет направленно объединить до 15 фрагментов ДНК в одной изотермической реакции. Сегодня методика широко применяется благодаря своей простоте и адаптивности.

Для проведения реакции необходима смесь из трёх ферментов:

• 5’-экзонуклеаза удаляет основания с 5’- концов двуцепочечных фрагментов ДНК. Образуются выступающие липкие концы, которые гибридизуются при постепенном охлаждении реакционной смеси, объединяя фрагменты друг с другом;
• ДНК-полимераза закрывает пропуски;
• ДНК-лигаза ковалентно сшивает фрагменты ДНК.

Для синтеза сборок по Гибсону из 5 фрагментов используют одноэтапный короткий протокол, а при увеличении их количества - двухэтапный. 

Для преодоления этих неудобств компания New England Biolabs разработала более совершенный метод сборки больших конструкций ДНК NEBuilder.

Набор Gibson Assembly® для сборки и клонирования ДНК-конструкций

• Бесшовная сборка за 60 минут;
• В набор включены компетентные клетки NEB® 5-альфа E.coli.

Набор NEBuilder® HiFi для сборки и клонирования ДНК-конструкций

• Бесшовная сборка за 15 минут;
• Единый протокол для любого количества фрагментов;
• Удаляет 5’ и 3’ ошибки спаривания нуклеотидов;
• В набор включены компетентные клетки NEB® 5-альфа E.coli.

Набор NEBuilder® HiFi для сборки и клонирования больших ДНК-конструкций

• Подходит для сборок длиннее 15 kb;
• Бесшовная сборка за 15 минут;
• Единый протокол для любого количества фрагментов;
• Удаляет 5’ и 3’ ошибки спаривания нуклеотидов;
• В набор включены компетентные клетки NEB® 10-бета E.coli.

Готовые наборы включают сбалансированную смесь ферментов, вектор для клонирования и компетентные клетки для трансформации.

Наборы NEBuilder HiFi могут применяться для различных видов сборок:

Технология Golden Gate позволяет синтезировать множественные упорядоченные вставки ДНК с помощью эндонуклеаз II типа и ДНК-лигазы бактериофага T4. Рестриктазы II типа способны разрезать ДНК на определённом расстоянии от сайта узнавания и, таким образом, создавать непалиндромные липкие концы. Благодаря возможности получить любой из 256 различных вариантов липких концов длиной 4 п.о. становится возможной сборка молекулы ДНК из большого количества фрагментов.

New England Biolabs предлагает два готовых набора для клонирования методом Golden Gate: с рестриктазой BsmBI-v2 и с рестриктазой BsaI-HFv2.

Мы собрали для вас несколько удобных онлайн-инструментов для планирования эксперимента по клонированию, чтобы ими воспользоваться просто перейдите по ссылке.

	NEBCutter Онлайн-инструмент для поиска сайтов рестрикции в заданной последовательности
	Double Digest Finder Онлайн-инструмент для подбора буферов для двойной рестрикции
	Enzyme Finder Онлайн-инструмент для подбора рестриктаз по названию, последовательности и др.
	REBASE База данных эндонуклеаз рестрикции

1. Выбрать метод клонирования в зависимости от задач и возможностей. 
2. Выбрать подходящие векторы, эндонуклеазы рестрикции (если требуются). 
3. Определиться с типом компетентных клеток и способом трансформации. 
4. Подобрать способ селекции клонов с наличием желаемой плазмиды. 
5. Выбрать способ выделения и анализа рекомбинантной ДНК.

Трансформация - это процесс, при котором организм приобретает экзогенную ДНК. Процесс трансформации может происходить двумя способами: естественным и искусственным. 

Существует широкий спектр методов для индукции поглощения экзогенной ДНК, т. е. повышения компетентности клеток. Самый распространенный способ заключается в использовании двухвалентных катионов (например, хлорида кальция) для увеличения проницаемости мембраны бактерий, что делает их химически компетентными. Еще один искусственный метод трансформации - электропорация, при которой на клетки воздействуют электрическим током, чтобы создать отверстия в бактериальной мембране. 

Правильный выбор компетентных клеток, подходящих под конкретные задачи исследователя, крайне важен для успешного клонирования. New England Biolabs поставляет несколько видов хемо- и электрокомпетентных клеток, позволяющих наработать большое количество целевой ДНК за короткое время

• Универсальные;
• Широкий выбор форматов поставки.

Компетентные клетки NEB® Turbo E.coli высокой эффективности

• Быстрый рост (< 8 часов);
• Подходят для химической и эктротрансформации.

Компетентные клетки NEB® 5-альфа F' Iq E.coli высокой эффективности 

• Хемокомпетентные
• Подходят для клонирования с «токсичным» геном.

Компетентные клетки NEB® 10-бета E.coli высокой эффективности

• Подходят для химической и эктротрансформации;
• Подходят для клонирования с «токсичным» геном;
• Строгий контроль экспрессии (laclq).

Компетентные клетки NEB® Stable E. coli высокой эффективности

• Универсальные;
• Подходят для клонирования с «токсичным» геном;
• Клонирование с векторами из ретро/лентивирусов.

Для большинства процессов в молекулярном клонировании крайне важны качественное выделение и высокая степень очистки нуклеиновых кислот. 

До начала клонирования необходимо выделить геномную ДНК для рестрикции целевой последовательности. Затем очистить НК от остатков различных ферментативных реакций. После трансформации клеток выделить уже рекомбинантные плазмиды. 

Линейка продуктов Monarch от New England Biolabs включает реагенты и расходные материалы для быстрого колоночного выделения и очистки ДНК без потери качества образца.

Набор Monarch® для выделения геномной ДНК 
Выделение и очистка геномной ДНК из клеточных культур, крови, тканей и других типов образцов.

• Сбалансированная буферная система позволяет получать высокий выход НК из широкого спектра образцов;
• Пиковая длина выделенных фрагментов >50 kb;
• РНКаза А и Протеиназа К включены в набор.

Набор Monarch® для выделения плазмидной ДНК 
Выделение до 20 мкг плазмидной ДНК из бактерий.

• Объем элюции всего 30 мкл;
• Включает цветные буферы для визуального контроля;
• Метод не требует добавления РНКаз.

Набор Monarch® для очистки ДНК-продуктов ПЦР и ферментативных реакций 
Выделение и концентрирование до 5 мкг ДНК из ферментативных реакций

• Объем элюции всего 6 мкл;
• Конструкция колонки обеспечивает полное вымывание буфера из образца;
• Простая модификация протокола позволяет удалять олигонуклеотиды и короткие фрагменты ДНК.