Реактивы, оборудование и
расходные материалы
для лабораторий
English version
пн-пт: 9:30-18:00 по МСК
0

#24 Альтернативные методы клонирования от New England Biolabs "без швов"

22.07.2015

Введение

На сегодняшний день существует ряд широко используемых методов клонирования - например, классическое клонирование, ПЦР-клонирование, рекомбинационное клонирование, а также клонирование при помощи независимого лигирования (LIC). Каждый из этих методов обладает своими преимуществами и недостатками. Каждый из этих типов может быть реализован при помощи ферментов и продуктов New England Biolabs.

В данном обзоре мы остановим наше внимание на подходе к клонированию, благодаря которому возможно не оставлять швов в местах соединения вставляемой последовательности ДНК. Рассмотрим методы альтернативного клонирования без "швов".

Группа методов клонирования, которые мы называем методами "бесшовного клонирования", объединяет в себе подходы, в которых обычно сочетаются элементы классических методов. В то же время уникальные решения позволяют вставлять один или более фрагментов ДНК в плазмидный вектор без добавления дополнительных последовательностей, что происходит, например - при классическом клонировании при помощи эндонуклеаз рестрикции. Вставка фрагмента, при альтернативном подходе, не должна зависеть от сиквенса последовательности и после вставки не должно оставаться "швов". Различные коммерческие системы, такие как Gibson Assembly, In-Fusion, GeneArt и др. используют ПЦР для амплификации интересующего гена, экзонуклеазу для отъедания одной из цепей на концах вставки и вектора. На последнем этапе может использоватья лигаза, или рекомбинацию, или восстановление in vivo, - для ковалентного соединения вставки в плазмиду через фосфордиэфирную связь. Возможность быстро встроить несколько фрагментов в любую последовательность вектора, делает такие методы очень соблазнительными. Также, возможность вставить 5-10 фрагментов в определенной, заданной заранее последовательности, без ограничения по сиквенсу фрагментов, обеспечивает мощный подход для решения сложных задач синтетической биологии. Например, обеспечивают перемещение целых оперонов для метаболического инжиниринга, или реконструкцию полного генома.

Среди преимуществ такого подхода к клонированию можно отметить следующие:

  • Возможность создания любого дизайна последовательности
  • Высокая эффективность клонирования
  • Эффективная сборка большого количества фрагментов
  • Высокая степень правильности сборки при большом количестве фрагментов

    У этого подхода, конечно же, имеются одновременно и недостатки :

  • Сравнительно дорогой метод по сравнению с классическими методами клонирования
  • ПЦР-праймеры и вставки должны быть сконструированы совместно, дизайн должен быть сделать перед началом экспериментов
  • Первый метод, который мы рассмотрим - это сшивка фрагментов ДНК в один этап по методу Гибсона, которая может быть обеспечена при помощи готовой смеси для лигирования NEBuilder от New England Biolabs.

    1. Сшивка по Гибсону при помощи готовой смеси для лигирования NEBuilder

    Процесс сшивки осуществляется в один этап - фрагменты ДНК, с перекрывающимися концами с течение одного часа инкубируются со смесью ферментов, в которые входят экзонуклеаза, ДНК-полимераза и ДНК-лигаза. Одновременно происходит отъедание 5'- концов дуплексов, узнавание комплементарных концов разных фрагментов, репарация пропусков ДНК-полимеразой и заделывание разрывов лигазой. Более подробно о методе можно прочитать в более раннем обзоре. Основные характеристики данного метода приведены в таблице 1.

    Характеристика продукта NEBuilder от New England Biolabs

    Цена в Евро (с НДС 18%)

    10 реакций – 186,4 Евро

    50 реакций – 745,8 Евро

    250 реакций 2979,5 Евро

    Количество собираемых фрагментов
    До 6 (до 12)
    Конечная длина собираемого фрагмента 300 т.п.о. (17 т.п.о.)
    Длина перекрывающихся концов 16-80 п.о.
    Очистка ПЦР-продуктов Возможно использовать ПЦР-продукты без очистки
    Программа для дизайна эксперимента NEBuilder (на сайте neb.com)

    Таблица 1. Основные характеристики смеси для лигирования NEBuilder от New England Biolabs.

    2. Клонирование при помощи метода Golden Gate

    Эффективная и бесшовная сборка фрагментов ДНК, обычно называемая сборкой Golden Gate, впервые была представлена в 1996, когда было показано, что многочисленные вставки могут быть собраны в скелет вектора при помощи эндонуклеаз рестрикции типа IIS и ДНК-лигазы Т4. Специфичность сборки обеспечивается уникальными выступающими сайтами, которые образуются при разрезании эндонуклеазами рестрикции за пределами сайта узнавания. Образующиеся ДНК фрагменты отжигаются с комплементарными участками участка ДНК, в который должно происходить лигирование. После сборки, сайт узнавания удаляется из конечной конструкции. Так как каждое лигирование соответствующих друг другу 4 оснований инертно (т.е. сайт узнавания рестриктазы уже не присутствует в конструкции). происходит накапливание желаемого конечного продукта. Это особенно хорошо использовать для сборки большого количества фрагментов - таких как Transcription Activator Like Effectors (TALEs) и TALEs прикрепленных к FokI нуклеазному каталитическому домену (TALENs). также метод Golden gate может быть использован и для клонирования одиночных вставок.

    Такой тип клонирования может быть реализован при помощи смеси для лигирования NEB® Golden Gate от New England Biolabs, в состав которой входит T4 ДНК лигаза, и рестриктаза BsaI (вообще может использоваться и другая рестриктаза типа IIS).

    Среди преимущества метода можно отметить следующие:

  • Клонирование без «швов» - не появляется дополнительных вставок в последовательности
  • Сборка нескольких фрагментов в одной реакционной смеси: одновременное лигирование и разрезание
  • Эффективно для регионов с высоким GC–составом и участками повтора
  • Эффективно работает применительно к фрагментам разного размера (< 100 п.о. до > 15 000 п.о.)
  • Доступно бесплатное приложение для дизайна эксперимента: GoldenGate.neb.com
  • Могут использоваться следующие рестриктазы от New England Biolabs: BsaI/BsaI-HF®, BbsI, BsmBI и Esp3I, а также набор NEB® Golden Gate
  • Разрезание происходит за пределами сайта узнавания, а так как сайт узнавания расположен дистально от сайта разрезания, то сайт узнавания отрезается и удаляется из сферы реакции
  • Специфические 4 основания (NNNN на рисунке) – позволяют вставлять несколько фрагментов
  • goldengate.png

    Рис.1. Схема реализации клонирования Golden Gate от New England Biolabs

    3. Клонирование с использованием USER подхода к клонированию

    Другим интересным и прогрессивным методом клонирования без образования вставок в сиквенсе является клонирование с использованием фермента USER и системы клонирования USER friendly.

    Фермент USER (Uracil-Specific Excision Reagent) образует одиночный нуклеотидный разрыв на месте урацила в цепи. Фермент USER - это смесь урацил-ДНК-гликозилазы (UDG) и ДНК гликозилазы-лиазы Эндонуклеазы VIII. UDG катализирует вырезание урацила, и формирует беспиримидиновый сайт, оставляя фосфодиэфирный скелет неповрежденным. Лиазная активность Эндонуклеазы VIII разрушает скелет по 3´ и 5´ сторонам беспиримидинового сайта, оставляя разрыв.

    USER_traтыдфеу.png

    Рис.2. Схема проведения клонирования при помощи фермента USER

    Метод ДНК-инженерии USER-friendly позволяет комбинировать сборку множества ПЦР-фрагментов, альтерацию последовательности нуклеотидов и прямое клонирование. При таком подходе, таргетные молекулы ДНК и вектор, в который производится клонирование - с 6-10 гомологичными парами оснований между соседники фрагментами. ПЦР-праймеры содержат одиночные остатки дезоксиурацила, и нависают на 3'-концами гомологичного региона, и их дизайн позволяет вводить нуклеотидные замены, вставки и/или делеции. Праймеры далее используются для амплификации вектора и интересуемого фрагмента ДНК. Последующая обработка GWH-фрагментов ферментом USER образует одиночные разрывы цепи на месте dU, освобождают липкие концы, которые встраивают фрагмент в линеаризованный вектор. Возможно встраивание большого количества фрагментов, а также множественные мутагенезные изменения, все это возможно провести в одиночном эксперименте.

    При USER-клонировании необходимо разбить эксперимент на два этапа:

    1. Дизайн праймеров, совместимых с вектором рNEB206A. Для экспресси протеинов можно включить ATG;
    2. Клонирование ПЦР-продуктов при помощи фермента USER.

    Заключение

    Мы надеемся, что сегодняшний обзор поможем Вам в Вашей ежедневной работе, и подарит новые идеи!

    Обратная связь

    © 2012-2019 SkyGen
    Информация и цены на сайте не являются публичной офертой
    На нашем веб-сайте мы используем файлы cookie, которые помогают нам создать максимально удобные для посетителя условия пользования сайтом. Если Вы продолжите использовать сайт, мы будем считать что Вас это устраивает.
    ОK