расходные материалы
для лабораторий
#22 Набор NEBNext Quant для количественной характеристики библиотек NGS для платформы Illumina методом реал-тайм ПЦР
На сегодняшний день, все исследователи, кто готовит библиотеки для секвенирования NGS на платформе Illumina, нуждаются в точном способе количественной характеристики приготовленных библиотек. Это является важным этапом, и обеспечивает оптимальный процесс генерации кластеров. Платформа Illumina требует использования библиотек высокого качества определенной концентрации.
Набор NEBNext Quant для Illumina позволяет аккуратно провести определение количества NGS библиотек, и сочетает в себе высокое качество и доступную стоимость. Набор позволяет характеризовать различные типы библиотек, которые приготовлены для секвенирования на платформе Illumina. Набор основан на технологии qPCR.
Набор NEBNext Quant совместим и протестирован со всеми наборами и модулями для создания библиотек NEBNext для Illumina.
Рис 1. Результаты, полученные с помощью набора NEBNext Quant на приборах Bio-Rad CFX96 Touch (A) и Applied Biosystems 7500 Fast для реал-тайм амплификации (B). Кривые амплификации показаны слева и после стандартизации справа. Все параметры при использовании платформ были выставлены по умолчанию. При использовании ABI 7500 Fast использовали 1X ROX (низкая концентрация) и нормализация по ROX.
Прекрасное разрешение
Применение
Для достижения более высокого качества секвенирования, плотность кластеров должна быть оптимальной, и количество библиотеки, которая берется для генерации кластеров должна быть внутри специфического разброса - для достижения оптимального секвенирования
В дополнение, при введении мультплексированной библиотеки, смесь должна быть эквимолярна для каждой из библиотек, это требует определения количества библиотеки также. Как видно на рисунке о генерации кластеров, фрагменты должны иметь адаптеры на каждом конце.
Компоненты набора:
Рис. 2. qПЦР обеспечивает меньший разброс в данных по концентрации NGS-библиотеки по сравнению с анализом при помощи Bioanalyzer®
Концентрации 4 библиотек определялись при помощи NEBNext Quant (оранжевый и результаты сопоставлялись с результатами определения полученными при помощи Aglient Bioanalyzer (голубой цвет). Видно, что разброс результатов, полученных при помощи набора NEBNext, в основе которое лежит qPCR, меньше, чем разброс данных, полученных при помощи Bioanalyzer.
Рис.3. Повышенная воспроизводимость результатов оценки количества библиотеки с использованием набора NEBNext Quant
Три NGS библиотеки, с длиной фрагментов 340–400 п.о. характеризовались с использованием 4 различных исследователей 2–4 раза с использованием набора NEBNext или KapaTM Library Quantification Kit (универсальный). Значительное улучшение результатов и уменьшение разброса наблюдались для концентраций библиотек с использованием NEBNext Kit (оранжевый) по сравнению с Kapa kit (серый).
Рис.4. Меньший разброс результатов с использованием различных лотом стандартов с использованием NEBNext Quant
Аккуратное определение с помощью qPCR требует использование использование ДНК чрезвычайного высокого качества с известной концентрацией. Набор NEBNext Quant содержит 4 стандартов полученных с высоким уровнем точности и низким разбросом. Этот рисунок показывает данные за >70 суммарного количества runs из 4 лотов обоих наборов NEBNext (оранжевый) и Kapa (серый) стандартов, со всеми Cq значениями на графике. NEBNext стандарты библиотек показывает более низкую вариацию в Cq, в результате получается меньший разброс в результатах изменения концентрации.
Рис.5.Набор NEBNext Quant позволяет получить оптимальные концентрации плотности кластеров.
7 различных библиотек были проанализированы с использованием набора NEBNext Quant (оранжевый) или набора Kapa Library Quantification Kit (универсальный) (серый). Концентрация неразбавленной библиотеки находилась в области от 2–200 нM. Библиотеки были разбавлены до 8 pM и загружены в MiSeq® (химия v2; MCS v2.4.1.3). Концентрации библиотек с использованием набора NEBNext характеризовались в примерной средней плотности 1160 к/мм2, напрямую в оптимальный диапазон 900–1300 к/мм2. Для сравнения, библиотеки, определенные при помощи Kapa в среднем в среднем 660 к/мм2.
Рис.6. Оптимальная плотность кластеров может быть достигнута с использованием набора NEBNext Quant, при использовании его для большого разброса библиотек различного размера и GC-состава.
Библиотеки с размером 310–963 п.о. из указанных источников были охарактеризованы при помощи NEBNext Quant, then diluted to 8 pM and loaded onto a MiSeq (v2 chemistry; MCS v2.4.1.3). Концентрация библиотек была в пределах 7–120 нM, и результирующая концентрация плотности кластеров для всех библиотек была 965–1300 к/мм2 (в среднем =1199). Оптимальная цоенцентрация кластеров достигалась с использованием набора NEBNext Quant для библиотек всех размеров.
Рис.7. Точная оценка количества библиотеки NGS для различного спектра различных размеров библиотек GC-состава.
Выборка нескольких библиотек были количественно охарактеризованы при помощи NEBNext Quant. Библиотеки были распределены по размеру, начиная от маленького размера (sRNA, FFPE) длиной150–230 п.о. до более длинных, длиной до 980 п.о. использовали большое количество различных источников, GC-состав варьировали от 20 до 70%, что показано при помощи цвета текста на рисункею. Библиотеки были подготовлены с использованием наборов для пробоподготовки NEBNext, Illumina TruSeq® Nano and Kapa Hyper (данные не представлены). Не было выявлено зависимости от размера или GC-состава библиотек во время определения концентрации библиотек с использованием NEBNext.
Материалы, которые не поставляются, но требуются для реализации протокола:
Все компоненты набора NEBNext Quant для Illumina могут храниться при –20°C в течение 2-х лет. Количество возможных циклов замораживания/размораживания для компонентов набора, включая готовую смесь NEBNext Quant и смесь праймеров - 30.
После добавления смеси праймеров к готовой смеси NEBNext Quant (см. протокол на странице 6), полученная смесь может храниться при –20°C в течение 7 месяцев. Для быстрого использования, эта смесь может храниться при 4°C в течение 6 недель.
Реакции могут готовиться при комнатной температуре, но неиспользованные части набора должны храниться на льду после раpмораживания.
