Реактивы и оборудование
для лабораторий
0

#20 Использование наборов случайных праймеров от New England Biolabs

05.06.2015

Многие из нас используют праймеры для проведения реакций ПЦР в нашей ежедневной работе, при необходимости. После завершения дизайна праймеров, их последовательность заказывается для синтеза.

Однако, многие производители, в том числе и New England Biolabs, предлагают в своих линейках наборы случайных праймеров, длиной 6 и 9 нуклеотидов, а также наборы модифицированных случайных праймеров.

Для реализации каких задач могут использоваться такие случайные праймеры?

1. Смеси случайных праймеров

Давайте начнем рассмотрение со смеси случайных праймеров от New England Biolabs. Использовние случайных праймеров широко применяется для синтеза первой цепи кДНК. Готовая к применению, оптимизированная смесь случайных гексамеров и праймеров с dT хвостом (dT23VN). Такая смесь обеспечивает оптимальное и равномерное покрытие образца РНК, для широкого спектра концентраций матриц РНК. В отличие от традиционного использования гексамеров как праймеров, данный способ помзволяет улучшить покрытие 3'-конца матрицы РНК.

Мы рекомендуем использовать смесь случайных праймеров для обратной транскрипции для следующих типов матрицы РНК:

  • РНК без poly(A) хвоста, такая как рибосомальная РНК
  • РНК со сложной вторичной структурой
  • Частично разрушенные образцы РНК
  • Целевые регионы 5´ длинных транскриптов мессенжер РНК
  • Рекомендация к использованию: смесь праймеров с концентрацией 60 µM содержит гексамеры с концентрацией 35 µM, и dT23VN с концентрацией 25 µM, а также dNTPs 1 mM

    2. Случайные праймеры (гексануклеотиды) и случайные праймеры (нанонуклеотиды)

    Случайные гексануклеотиды со случайным составом (5' d(N6 ) 3' [N=A,C,G,T] ), случайные нонануклеотиды (5' d(N9) 3' [N = A,C,G,T]) используются как праймеры при синтезе ДНК in vivo, они садятся на большое количество отрезков денутурированного образца ДНК. Комплекс гексаолигонуклеотидов с образцом ДНК является подходящим субстратом для ДНК-полимеразы I (фрагмент Кленова). Полученная в результате такой амплификации ДНК "метится" , если заменить один из радиоактивных нуклеотидов на соответствующий нерадиоактивный в реакционной смеси. Использование синтетических d(N)6 праймеров позволяет обеспечить наличие практически всех комбинаций последовательности гексамеров, в результате чего получают равномерно помеченную ДНК, с высокой специфичной активностью. После мечения при помощи этого метода, получают зонды, которые можно использовать для скрининга генных библиотек, для гибридизации in situ, и для Southern и Northern blot.

    3. Олиго-(дТ)18 VN праймер

    Oligo d(T)23 VN используется как праймер при секвенировании mRNA, которая имеет присоединенный 3'-poly A хвост. Где V = A or G or C, N = A or G or C or T.

    Олиго-dT праймер отжигается на 3’-конце поли-А хвоста мРНК и обеспечивает синтез протяженных цепей кДНК. Смесь случайных праймеров состоит из праймера d(T)23VN и случайных гексамерных праймеров, отжигающихся на РНК-матрице случайным образом. Эта смесь подходит для синтеза более коротких цепей кДНК. В качестве матрицы для синтеза кДНК может использоваться как тотальная РНК, так и мРНК.

    5. ДНК-полимераза Phi29 и смесь случайных праймеров

    Кроме использования случайных праймеров в реакциях с ДНК-полимеразой I (фрагмент Кленова) - они применяются также для способа накопления ДНК. Для этого может использоваться ДНК-полимераза phi29, которая характеризуется высокой производительностью, и праймеры случайной последовательности. Реакция, осуществляемая Phi29, эффективно протекает при постоянной температуре. С помощью полимеразы Phi29 из одной копии генома можно получить несколько микрограмм геномной ДНК, необходимой для анализа из единичной микробной клетки. В ходе реакции амплификации ДНК разветвляется, на только что синтезированные цепу уже могут садиться новые праймеры. В данной процедуре существуют два момента, которые, пока, не удаётся полностью преодолеть.

    Важно отметить, что случайные праймеры могут быть использованы для реакций с ДНК-полимеразой Bsu, или другими полимеразами для синтеза второй цепи или мечения олигонуклеотидов.

    4. Использование наборов случайных праймеров в наборах для синтеза первой цепи кДНК от New England Biolabs

    Давайте теперь остановимся на подборе комбинации наборов случайных праймеров, которые реализуются в наборах New England Biolabs, например, в наборе для синтеза первой цепи кДНК ProtoScript®II.

    Олиго d(T) праймеры предпочтительны для большинства приложений, т.к. они могут обеспечить, чтобы все копии кДНК заканчивались на 3´ конце мРНК, и позволяют получить наиболее длинные непрерывные кДНК. Заякоренный oligo-d(T) праймер (d(T)23VN) заставляет праймер отжигаться до начала polyA хвоста, предотвращая закрепление праймеров внутри polyA хвоста. тем не менее, возможно использовать два других варианта дизайна праймеров, при желании.

    Случайная смесь праймеров, использующая в данном наборе состоит из случайных гексамеров и d(T)23VN праймеров. Таким образом обеспечивается закрепление праймеров, по всей последовательности образца РНК, включая как mRNAs , так и не полиаденилированную РНК (такая как рибосомальна РНК). Случайная смесь праймеров позволяет получать более короткие кДНК в среднем, и может быть использована для детекции большого количества коротких RT-PCR продуктов (ПЦР продуктов реакции обратной транскрипции). Смесь обеспечивает хорошие и стабильные результаты для широкого спектра матриц РНК.

    Тот же принцип реализуется при оптимизации смеси случайных праймеров для набора ProtoScript® AMV для синтеза первой цепи кДНК и набора ProtoScript® M-MuLV для синтеза первой цепи кДНК.

    При использовании для синтеза кДНК ген-специфических праймеров, кДНК продукт может быть использован только для амплификации одного отдельного транскрипта. Этот метод дает хорошие результаты при лимитированном (меньше 10 нг) количестве РНК.

    Мы надеемся, что наш обзор поможет взглянуть с новой стороны на случайные праймеры и возможности их применения!

    Обратная связь

    © 2012-2019 SkyGen
    Информация и цены на сайте не являются публичной офертой
    Изготовление сайта – НБС-Медиа
    На нашем веб-сайте мы используем файлы cookie, которые помогают нам создать максимально удобные для посетителя условия пользования сайтом. Если Вы продолжите использовать сайт, мы будем считать что Вас это устраивает. ОK