#1 Метод Гибсона для эффективной сшивки большого количества длинных фрагментов двухцепопочечных ДНК

Метод Гибсона позволяет успешно производить сборку множества фрагментов ДНК, невзирая на длину фрагментов и степень совместимости их концов друг с другом. Вскоре после первого применения метод Гибсона был адаптирован для нужд синтетической биологии. Сегодня методика широко применяется благодаря своей простоте, возможности применения для больших конструкций ДНК, и тому, что она легко подстраивается для любой конкретной задачи.

Предлагаемый набор позволяет эффективно сшивать большое количество фрагментов ДНК с перекрывающимися концами в одной изотермальной реакционной смеси (1,2) и может быть реализован на практике при помощи продукта компании Gibson Assembly Master Mix (NEB by Synthetic Genomics).

Реакционная смесь продукта включает в себя три различных энзиматических реактива, функционирование которых обеспечивется единым буферным раствором:

1. 5’-экзонуклеаза удаляет основания с 5’- концов двуцепочечных фрагментов ДНК и создает одноцепочечные 3’-концы ДНК нити, которые гибридизуются во время постепенного охлаждения реакционной смеси, объединяя фрагменты друг с другом;
2. ДНК-полимераза закрывает пропуски внутри каждого образовавшегося после отжига фрагмента;
3. ДНК-лигаза ковалентно сшивает фрагменты ДНК.

На рисунке представлена принципиальная схема, которая лежит в основе методики. После охлаждения реакционной смеси получают непрерывные двухцепочечные фрагменты ДНК, которые могут быть использованы далее для ПЦР, циклической амплификации или в других биологических процессах, включая прямую трансформацию. Данный метод был использован группой Гибсона и другими для сборки олигонуклеотидов длиной до нескольких сотен тысяч п.о., обладавших длиной перекрывающихся фрагментов от 15 до 80 п.о. (1-3).

Основными преимуществами Gibson Assembly Master Mix, которые привлекают пользователей являются:

1. хорошие результаты при сшивании длинных фрагментов ДНК, а также большого количества фрагментов разной длины;
2. возможность использования для различных последовательностей ДНК, без необходимости специального проектирования сайта клонирования;
3. сборка фрагментов, полученных среди продуктов ПЦР между собой минуя этап очистки реакционной смеси после ПЦР;
4. возможность осуществить сложную сборку фрагментов в течение 1 часа;
5. использование полученных сшитых фрагментов ДНК непосредственно для трансформации, или в качестве матрицы для ПЦР и амплификации по типу катящегося кольца;
6. простая адаптация к различным манипуляциям с ДНК, включая сайт-направленный мутагенез, вставки и делеции.

Gibson Assembly Maser Mix эффективно обеспечивает сборку фрагментов ДНК различной сложности, и может быть выбран исследователями при сборке двухцепочечной ДНК из большого количества частей. Так, фрагменты ДНК, полученные сшиванием 6 фрагментов с использованием набора, были использованы для трансформации. Полученные колонии были протестированы на наличие собранного фрагмента ДНК. Проводили ПЦР с использованием праймеров для амплификации всего фрагмента целиком, и наблюдали 100% правильность собранных фрагментов.

Как уже упоминалось выше, Gibson Assembly Master Mix может быть использован для сборки фрагментов непосредственно после реакции ПЦР, без колоночного очищения или экстракции хлороформом/фенолом.

Некоторые советы по использованию помогут упросить работу с Gibson Assembly Master Mix и обеспечить успешную сборку и последующую трансформацию собранного  фрагмента ДНК:

1. успешная транформация с использованием полученного фрагмента ДНК напрямую зависит от компетентности использованных клеток;
2. электропорация может увеличить эффективность трансформации. Если Gibson Assembly Master Mix используется при электропорации, необходимо разбавить реакционную смесь в 3 раза и использовать 1µL смеси для трансформации;
3. очищенные ДНК, используемые для сборки, разбавляют в dH (MilliQ или эквивалент), ТЕ или других буферах;
4. для оптимизации сборки, доведите объем ДНК до 10 µL. Если объем раствора фрагментов ДНК больше чем 10 µL, объем реагента необходимо увеличить пропорционально;
5. при сборке непосредственно в вектор клонирования, концентрация фрагментов должна быть в 2-3 раза выше концентрации самого вектора. При клонировании в вектор, необходимо использовать в 2-3 раза больше вставки или собранного фрагмента;
6. некоторые структуры ДНК, включающие в себя инвертированные или тандемные повторы, также как некоторые рекомбинантные протеины плохо совместимы с E.Coli, что может проявляться в плохой трансформации и образовании маленьких по размеру колоний.

Литература:

1. Gibson, D.G. et al. (2009) Nature Methods, 343-345.
2. Gibson, D.G. et al. (2009) Nature Methods, 901-903.
3. Gibson, D.G. Personal communication.

Дополнительная информация о Gibson Assembly Master Mix может быть также получена на следующих ресурсах: http://www.syntheticgenomics.com и http://www.jcvi.org

Если Вы заинтересовались новым продуктом, Gibson Assembly Master Mix можно ЗАКАЗАТЬ.