ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени

ПЦР в реальном времени (real-time PCR, qPCR) — это метод, основанный на принципе полимеразной цепной реакции. С его помощью можно определять присутствие ДНК в образце, а также ее количество в реальном времени.
Метод ПЦР в реальном верени схож с обычной ПЦР, однако в реакцию добавляются флуоресцентные метки или интеркалирующий краситель. По интенсивности свечения или окрашивания можно оценивать количество ДНК. Для этого строятся специальные кривые зависимости интенсивности сигнала от времени. Существуют два способа детекции ПЦР-продуктов: неспецифическая, при помощи красителей, и специфическая, при помощи ДНК-зондов.
Интеркалирующие красители, такие как SYBR Green, способны вcтраиваться в спираль ДНК, что сопровождается усиленной флуоресценцией. Соответственно, они связываются с любой двухцепочечной ДНК, которая формируется по ходу реакции, в том числе с побочными продуктами. Однако такие красители дешевы и удобны в использовании, а также позволяют разделять разные типы ДНК в образце по их температуре плавления. График зависимости флуоресценции от температуры отражает особенности нуклеотидной последовательности. Благодаря этому можно обнаруживать мутации и проводить генотипирование.
ДНК-зонды, меченые флуорофорами, связываются только с выбранной последовательностью. Обычно они состоят из самого зонда, флуоресцентного репортера и молекулы, ответственной за тушение флуоресценции. Пока флуорофор и гаситель находятся близко друг к другу, свечение не детектируется. Если зонд связывается с таргетной последовательностью или разрушается ДНК-полимеразой на очередном цикле, это сопровождается флуоресценцией.
Одно из применений реал-тайм ПЦР — измерение экспрессии генов. В этом случае выполняется ПЦР с обратной транскрипцией, позволяющая получить кДНК, комплементарную целевой мРНК. Для точного расчета исходного количества НК обычно применяют калибровочные кривые, построенные на основе амплификации в ПЦР генов домашнего хозяйства, для которых это количество известно — соответственно, известен и уровень экспрессии, что позволяет нормализовать данные на константу.
Большое значение real-time ПЦР имеет и в лабораторной диагностике. С его помощью можно обнаруживать патогены человека, животных и растений, маркеры раковых клеток, виды микробов в образцах из окружающей среды. ПЦР в реальном времени позволяет оценить вирусную нагрузку, а также генотипировать штаммы вирусов. Измерение количества определенных микроорганизмов в воде или пище позволяет определять ее качество.
Широкое распространение получил метод диагностики COVID-19 при помощи реал-тайм ПЦР с обратной транскрипцией. Считается, что такой способ детекции патогенов снижает вероятность контаминации, так как отсутствуют сложные дополнительные манипуляции. Основанные на ПЦР в реальном времени тесты не требуют высокой квалификации экспериментатора и отличаются высокой чувствительностью и специфичностью. Аналогичные преимущества реал-тайм ПЦР имеет и по сравнению с иммуноферментным анализом, направленным на детекцию антигенов микроорганизмов.
На сайте можно найти наборы для детекции SARS-CoV-2, а также проведения ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени для любых целей.

сообщество.png
Nanopore: сообщество пользователей

АКЦИИ

Жаркая скидка на все товары Nimagen!

Бесплатная доставка

ОБЗОРЫ

Выращивание органов – фантастика или уже реальность?

Нанопоровое секвенирование: обзор статей

наши группы в соцсетях

ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени

Настройки файлов cookie

Категории файлов cookie: