Карта рестриктаз NEB

Ниже представлены инструменты, которые позволят подобрать идеальную рестриктазу для ваших индивидуальных задач.

Таблица со справочной информацией по рестриктазам NEB: сайты рестрикции, температура работы, совместимые буферы и особые свойства.

Таблица сравнения различных буферов NEB, с которыми поставляются рестриктазы.

Онлайн-инструмент NEBcutter для поиска сайтов рестрикции в заданной последовательности.

Онлайн-инструмент Enzyme Finder для подбора рестриктаз по названию, последовательности и др.

Онлайн-инструмент Double Digest Finder для подбора буферов для двойной рестрикции.

База данных эндонуклеаз рестрикции

Компания New England Biolabs (NEB) заслужила репутацию лидера в области ферментных технологий за более чем сорокапятилетнюю историю производства ферментов рестрикции. NEB стремится разрабатывать ферменты с инновационными характеристиками и совершенствовать методы очистки, тем самым подтверждая статус лидера области. SkyGen является официальным дистрибьютором продукции New England Biolabs в России и СНГ.

New England Biolabs предлагает полный набор инструментов, необходимых не только для проведения эксперимента, но и для составления карты рестрикции и подбора необходимых условий. Эндонуклеазы рестрикции используются для перемещения любого фрагмента ДНК из одного вектора в другой, а также для вставки ПЦР-фрагмента или библиотеки фрагментов в вектор. Метод легко осуществим, если фрагмент ДНК окружен теми же сайтами рестрикции, которые присутствуют в целевом векторе.

В чем же заключается подготовительный этап молекулярного клонирования при помощи эндонуклеаз рестрикции?

Первым и главным шагом является создание дизайна желаемой конструкции и карт рестрикции имеющегося материала: вставки и вектора — плазмиды, в которую будет заклонирована желаемая последовательность. С составлением карты рестрикции исследователям помогают различные инструменты: анализатор последовательностей от Addgene, SnapGene, NEBcloner или Benchling. Программа NEBcutter V2.0 позволяет загружать последовательности ДНК и находить большие неперекрывающиеся открытые рамки считывания и сайты для всех рестрикционных ферментов типа II и всех коммерчески доступных ферментов типа III. При помощи этого инструмента можно дополнять и модифицировать карты рестрикции. Задача составления и аннотации карты - определить, какие сайты рестрикции присутствуют в данной последовательности.

При выборе рестрикционных ферментов необходимо делать выбор в пользу тех, сайты рестрикции которых:

-       окружают вставку, но при этом не вносят в нее разрывы

-       находятся в определенном нужном месте в плазмиде-векторе: окружают сайт множественного клонирования, но не вносят разрывы в других местах плазмиды

-       позволяют гарантировать, что вставка будет иметь правильную ориентацию

-       находятся в рамке считывания с тэгами, флуоресцентными белками или другими необходимыми модификациями в плазмиде-векторе.

Помимо специфической последовательности для узнавания, для составления карт рестрикции необходимо знать, оставляет рестриктаза тупые концы или липкие, на 3’-конце или 5’-конце, делает ли отступ от узнаваемой последовательности при внесении разрывов. Инструмент Enzymefinder от NEB позволяет найти всю доступную информацию о рестриктазах по их названию, сайтам рестрикции или свойствам. Для сравнения различных эндонуклеаз рестрикции компания предлагает использовать таблицу свойств всех доступных ферментов. В таблице указаны сайты рестрикции, совместимые буферы, температура и скорость работы, а также другие свойства.

Для клонирования можно использовать один фермент, но для этого потребуется обработка плазмиды-вектора фосфатазой, а также дополнительная проверка правильности вставки. В большинстве случаев исследователи используют два разных рестрикционных фермента для клонирования. Если не удалось подобрать нужное сочетание рестриктаз, можно добавить желаемые сайты рестрикции к вставке в ходе ПЦР, если добавить сайты рестрикции на концы праймеров. Это позволит создать вставку, фланкированную сайтами рестрикции, совпадающими с сайтами рестрикции на векторе. Программы для создания карт рестрикции, например, NEBcloner, позволяют провести симуляцию клонирования для того, чтобы убедиться в правильности выбора ферментов.

Активность эндонуклеаз рестрикции зависит от буферного раствора, в котором протекает реакция. У компании New England Biolabs есть список буферов для рестрикции при помощи ферментов производства компании. В программе NEBcloner при помощи инструмента Double Digest Finder можно проверить, будет ли пара выбранных рестрикционных ферментов работать в одном и том же буфере ферментов. Совместимость двух рестриктаз с одним буфером сэкономит время исследователя.

Таким образом, ключевыми этапами дизайна конструкций для молекулярного клонирования являются следующие действия: определение последовательности вставки и вектора, подбор необходимых ферментов и буферных растворов, создание карты рестрикции и компьютерная симуляция клонирования. Так исследователь может быть уверен в правильности выбора реактивов для создания необходимых конструкций.