Серия реактивов NEBNext для секвенирования следующего поколения

С появлением в 2005 году платформ для секвенирования следующего поколения компаний Illumina^®, Roche 454™ и Life Technologies (SOLiD™, Ion Torrent™) мир секвенирования нуклеиновых кислот резко изменился.

Основным этапом в пробоподготовке стало создание библиотек нуклеиновых кислот, основанное на серии стандартных молекулярно-биологических реакций, в числе которых реакция «зачистки» концов, лигирование, ПЦР.

Широкое признание технологий NGS в мире привело к быстрому расширению числа их применений в анализе ДНК и РНК, а увеличение производительности секвенаторов создало потребность в надежных, недорогих и экономящих время исследователей техниках пробоподготовки.

Компания NEB разработала серию реактивов NEBNext - наборы ферментов, нуклеотидов и буферов - с учетом технологий секвенирования мировых лидеров в области NGS, Illumina, 454, SOLiD и Ion Torrent, совместимые с платформами этих производителей. Прилагаемые к ним протоколы делают процесс пробоподготовки эффективным, недорогим и надежным.

Все реактивы серии NEBNext проходят валидацию путем приготовления библиотек и их последующего секвенирования на соответствующих платформах NGS, что подтверждено соответствующими валидационными письмами.

Реактивы NEBNext доступны в разных комбинациях, что увеличивает гибкость планирования экспериментов и экономию средств:

• наборы реактивов содержат в своем составе ферменты, нуклеотиды и буферы для проведения всех этапов пробоподготовки,
• наборы Master mix содержат те же компоненты, но частично уже смешанные для ускорения процесса пробоподготовки,
• модули содержат специфические компоненты для проведения отдельных этапов пробоподготовки,
• для удобства реактивы NEBNext доступны в различных фасовках.

На данный момент серия NEBNext представлена:

1. реактивами для создания:
   - геномных библиотек для секвенирования на платформах Illumina, Roche 454, SOLiD, Ion Torrent,
   - библиотек РНК для секвенирования на платформах Illumina, SOLiD, Roche 454,
   - библиотек Chip-Seq для Illumina
2. модулями для проведения отдельных этапов пробоподготовки:
   - восстановления концов ДНК
   - быстрого лигирования
   - безматричного 3’-аденилирования
   - фрагментации РНК
   - выделения поли(А)+ РНК
   - синтеза второй цепи мРНК

NEB предлагает также уникальный фермент NEBNext^® дцДНК Fragmentase^® , заменяющий соникаторы и небулизаторы. Фрагментация матрицы с помощью дцДНК Fragmentase позволяет получать фрагменты ДНК размером от 100 до 800 п.н. в зависимости от времени проведения реакции с более высоким практическим выходом нежели при использовании механической фрагментации с применением соникаторов и небулизаторов.

На рисунке показано распределение относительного размера фрагментов ДНК E.coli, полученных обработкой образца ДНК дцДНК Fragmentase (синяя кривая) и пневматическим небулизатором (зеленая кривая), визуализированное с помощью анализатора Bioanalyzer 2100.

Образец, обрабатываемый дцДНК Fragmentase, инкубировали в течение 30 минут при 37°C в 1X буфере для фрагментазы с БСА (100 мкг/мкл) при соотношении 0.05 мкг ДНК на 1 мкл дцДНК Fragmentase. Образец, фрагментированный с помощью небулизатора, был подвергнут распылению в 50% глицерине в течение 6 минут при давлении 35 psi.