Конструирование РНК-эндонуклеаз с заданной специфичностью

Открытие около 40 лет назад рестриктаз ДНК II типа стало началом эры рекомбинантых ДНК. В то же время, ферментов, способных специфически разрезать РНК, в природе найдено не было. Создание таких РНК-рестриктаз значительно расширило бы спектр возможных манипуляций с РНК как in vivo, так и in vitro.

Ученые из Университета Северной Каролины сконструировали новый класс эндорибонуклеаз, названный ими ASRE (artificial site-specific RNA endonucleases). Ферменты этого класса специфически узнают сайт из 8 нуклеотидов в последовательности РНК и делают единичный разрез. Для создания РНК-рестриктаз был использован принцип модульного дизайна.

В качестве модуля, распознающего специфический сайт, был выбран уникальный РНК-связывающий домен PUF белка PUM1 человека, который содержит 8 повторов, распознающих 8 следующих друг за другом нуклеотдидов в последовательности РНК (см. рис. слева). Изменяя аминокислотные остатки в каждом из повторов, можно перепрограммировать специфичность PUF домена. В качестве модуля, рестрицирующего РНК, был выбран эндонуклеазный PIN домен белка SMG6. Два модуля были соединены между собой олигопептидным линкером.

Авторы установили, что эффективность работы такой искусственной рестриктазы зависит, в первую очередь, от ориентации PUF и PIN домена друг относительно друга, от длины, состава и структуры линкера, от наличия в реакционной среде ионов Mn²⁺ (или некоторых других двухвалентных ионов).

На примере одной из ASRE путем клонирования продуктов рестрикции было показано, что имеется 2 основных сайта разрезания, которые не совпадают с сайтом узнавания, но лежат рядом с ним, и что каждая молекула РНК разрезается только по одному из этих сайтов.

На электрофореграмме показано расщепление РНК-субстрата рестриктазой ASRE(6-2/7-2), распознающей последовательность 5'-UUGAUAUA-3' (дорожка 2, 4), расщепление РНК-субстрата мутантной ASRE(6-2/7-2), в которой домен PIN инактивирован (дорожка 3) и расщепление РНК-субстрата ASRE(6-2/7-2) с инвертированной ориентацией доменов (дорожка 5, 6).

Одним из возможных направлений применения нового класса ферментов является подавление генной экспрессии, особенно в тех системах, в которых отсутствует машинерия РНК-интерференции. Так, авторы сконструировали рестриктазу ASRE, которая специфически разрезает транскрипт гена lacZ E.coli. При экспрессии этой ASRE в клетках E.coli наблюдалось значительное снижение активности β-галактозидазы.

Кроме того, при присоединении к ASRE N-концевого сигнального пептида, облегчающего импорт белков в митохондрии, авторам удалось добиться подавления экспрессии гена ND5 в митохондриях клеток линий HeLa и 293T человека.

Ссылка на статью: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23093184
Полной версией мы с удовольствием поделимся по запросу!