Изменение специфичности эндонуклеазы рестрикции MwoI

К настоящему времени выделено более 3000 эндонуклеаз рестрикции, но в совокупности они обладают менее чем 300-ми специфичностями. Поскольку скорость открытия новых специфичностей в последнее время резко снизилась, стало развиваться новое направление биоинженерии - изменение специфичностей уже открытых и выделенных рестриктаз.

Эдонуклеаза рестрикции MwoI - рестриктаза IIP типа, которая была выделена из грамотрицательной бактерии Methanothermobacter wolfeii.

Сайт распознавания ДНК этой рестриктазы представляет собой палиндромную последовательность:

Фермент гидролизует фосфодиэфирную связь между 7-м и 8-м нуклеотидом в обеих цепях ДНК с образованием 3'-липких концов.

Ученым из Международного института молекулярной и клеточной биологии Польши с помощью компьютерного моделирования удалось выявить аминокислотные остатки в последовательности фермента, которые отвечают за распознавание определенной последовательности ДНК, и провести их направленный мутагенез.

В частности, проведя в 310-м положении фермента замену серина на аргинин или глутаминовую кислоту, они получили варианты фермента, которые имеют специфичность, отличную от специфичности фермента дикого типа.

Мутант S310R MwoI гораздо предпочтительнее распознает последовательность 5’‑GCСNNNNNGGC‑3’,
а мутант S310E - 5’‑GCGNNNNNCGC‑3’,
при этом эффективность рестрикции S310E зависит от нуклеотидов, стоящих в 3-м и 9-м положениях.

На электрофореграмме показано расщепление плазмидной ДНК нативной эндонуклеазой рестрикции MwoI (Wt) и мутантами (E - S310E мутант, R - S310R мутант).
M - стандарт длин ДНК (ДНК pUC19, обработанная рестриктазой MspI).