#33 Результаты апробации реагентов от New England Biolabs нашими клиентами!

Уважаемые друзья! Мы регулярно собираем отзывы пользователей из ведущих лабораторий России о нашей продукции. У нас теперь накопилось большое их число, и мы хотим начать серию обзоров, с результатам апробаций. Надеемся, что эта информация будет полезна вам!

1. Сравнение ДНК-полимераз NEB для ПЦР анализа клонов фаговой библиотеки.

Проводили ПЦР анализ клонов фаговой библиотеки, полученной из генов легких цепей иммуноглобулинов крови больных СКВ. Для ПЦР использовали продукты ДНК-полимеразы OneTaq (M0480G) и ДНК-полимеразы Taq в виде готовой смеси x2 (M0270L) (рис 1 и 2, соответственно). Реакционная смесь для ПЦР (50 мкл) содержала: 2,5 мМ смесь четырех стандартных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTPmix), 1 ед. удельной активности Taq ДНК-полимеразы, 5 мкл буфера для Taq-полимеразы, до 100 нг исследуемой плазмиды и 0,6 мкМ смесь праймеров (индекс 1 - P1+P3, индекс 2 - P2+P3). Реакционную смесь инкубировали 25 циклов (амплификатор «Бис», ДНК технология, Россия): 98 °С – 10 с, 50 °С – 5 с, 60 °С – 4 мин, 98 °С – 3 мин. Затем 5 мин при 72 ºС, после чего реакционная смесь охлаждали до 0 ºС.

Электрофоретический анализ продуктов ПЦР. Клоны 31–40.

311 312 321  322 331 332 341342 351 352 371 372 381 382 391 392 401 402     МЭлектрофоретический анализ продуктов ПЦР. Клоны 8–14.

M     81  82  91  92  101  102  111  112  121  122  132  131  141  142

ПЦР: 1 – праймеры Р1+Р3 –продукт 900 п.н.; 2 – праймеры Р2+Р3 – продукт 700 п.н. Праймер Р1: 5'- GGA AAС AGC TAT GAC CAT G-3' для отжига (+) цепи ДНК V домена. Праймер Р2: 5'-TTT CAA CTG CTC АТС AGA-3' для отжига (-) цепи ДНК константного домена, соответствующему 121-126 остатку. Праймер P3: 5'-GAA TTT TCT GTA TGA GG-3' для отжига (-) цепи ДНК V домена. Продукты реакции анализировали разделением в 1,5 % агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием (0,5 мкг/мл, 2–4 ч).

Как видно из рисунков, вставка есть в клонах 8, 10, 11, 34, 35, 37. Оба продукта NEB: M0480G и M0270L позволили получить качественные продукты ПЦР.

2. Отзыв на ДНК-полимеразу Q5.

Во время эксперимента проводилась наработка (CGG)n повтора в гене YYYY в ПЦР c ДНК различных линий клеток. Цель – наработать ГЦ богатый участок. Видно на рис 3, что ДНК-полимераза Q5 справилась лучше, чем Taq в смеси с DMSO. Условия постановки реакции - стандартные (с сайта производителя ДНК-полимеразы Taq и протокол для Q5 с сайта neb.com)

В дальнейших обзорах мы продолжим публикацию результатов наших любимых клиентов!