#30 Редактирование генома: инструменты для реализации протокола CRISPR/Cas9

01.11.2015

Введение

Редактирование генома стало возможным, благодаря развитию инструментов, которые могут с очень высокой точностью вызвать заданные изменения в геноме живых клеток. Последние подходы к направленной модификации генома - цинк-зависимые нуклеазы (ZFNs) и активаторы транскрипции, такие как эффекторные нуклеазы (TALENs)– позволили исследователям создавать мутации при помощи введения двойных разрывов в молекулярном каскаде активации системы репарации. Эти подходы стоят достаточно дорого и занимают время для дизайна, не позволяя широко использовать данную методику, особенно для широкомасштабных исследований в большом потоке.

Эта технология редактирования генома была использована в течение последних лет для манипуляции в функцией генов, включая гомологичную рекомбинацию и интерферирование РНК. iРНК в частности, стали потоковой технологией в лаборатории - недорогой и высокопроизводительный метод нарушения функций генов, но недостатками его являются только временное ингибирование генной функции и зачастую непредсказуемый ненаправленный эффект. Тем не менее, методы, которые основаны на CRISPR-ассоциированном белке, 9 нуклеазе (Cas9) из Streptococcus pyogenes, дали повод для оптимизма.

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) и CRISPR-ассоциированные (Cas) гены являются важными для адаптивной иммунологии в выбранных бактериях и архаэях,позволяя организмам отвечать и удалять вторгающийся генетический материал. На рисунках 1 и 2 можно увидеть принципиальную схему реализации протокола по редактированию генома.

Рис.1. Схема механизма процесса редактирования генома с помощью протокола CRISPR

Простота системы редактирования генома CRISPR при помощи нуклеаз, в которую входят лишь три компонента - это Cas9, crRNA и tracrRNA, делают эту систему более привлекательной для использования в лаборатории.

Рис.2. Схема механизма процесса редактирования генома с помощью протокола CRISPR

Компания New England Biolabs предлагает ряд продуктов, при помощи которых возможно начать работу вашей лаборатории по протоколу CRISPR.

Продукты от New England Biolabs, которые помогут реализовать протокол CRISPR

Product Name	CRISPR/Cas9 Application	NEB #	Size
NEW Cas9 Nuclease, S. pyogenes	Central component in the generation of CRISPR-based immunity - catalyzes site-specific cleavage of double-stranded DNA	M0386S	50 rxns
Q5® Site-directed Mutagenesis Kit (with or without competent cells)	Insertion of target sequence into the Cas9-sgRNA construct	E0554S/E0552S	10 rxns
Q5® High-fidelity DNA Polymerases	High-fidelity construct generation for use with CRISPR workflows	Multiple	Multiple
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	Single-tube, isothermal generation of the Cas9-sgRNA construct	E2621S/L	10/50 rxns
NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit	Single-tube, isothermal generation of the Cas9-sgRNA construct	E5520S	10 rxns
T7 Endonuclease I	Determination of the targeting efficiency of genome editing protocols	M0302S/L	250/1,250 units
HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit	Generation of sgRNA	E2040S	50 rxns
HiScribe™ T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit	Generation of sgRNA	E2050S	50 rxns
HiScribe™ T7 ARCA mRNA Kit (with tailing)	Generation of sgRNA	E2060S	20 rxn
HiScribe™ T7 ARCA mRNA Kit	Generation of sgRNA	E2065S	20 rxns