Реактивы, оборудование и
расходные материалы
для лабораторий
0

#9 Как найти свою ДНК-полимеразу среди многообразия ферментов от New England Biolabs? (Часть 2)

13.11.2014

Сегодня мы продолжим рассматривать различные типы ДНК-полимераз от компании New England Biolabs, разделив их по блокам согласно задачам, которые могут решаться с их помощью.

Изотермальная амплификация

ПЦР в классическом понимании включает в себя повторяющийся цикл изменения температуры инкубации реакционной смеси. В то же время существуют другие методы сиквенс-специфичной амплификации ДНК.

Предложенный в 2000 г. метод изотермальной петлевой амплификации (LAMP) - новый, эффективной и относительно малозатратный метод, который может быть осуществлен в лабораториях, не имеющих сложного оборудования, или в поле.

LAMP позволяет амплифицировать целевые последовательности ДНК в изотермальных условиях. В этом случае нет необходимости применять амплификаторы, достаточно иметь нагревательный блок, для установки постоянной температуры 60-65°C. Используются 4-6 праймеров (прямых и обратных внутренних, прямых и обратных внешних), направленных на 6-8 различных комплементарных участков ДНК. Такой подход повышает специфичность амплификации.

Для проведения изотермальной амплификации могут быть использованы следующие ДНК-полимеразы от New England Biolabs: Bst 2.0 ДНК-полимераза, Bst 2.0 WarmStart® ДНК-полимераза, полноразмерная Bst ДНК-полимераза, большой фрагмент Bst ДНК-полимеразы , фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I (без 3' - 5' экзонуклеазной активности). Все они обладают хеликазной активностью, которая требуется для проведения амплификации при постоянной температуре. В то же время, NEB предлагает воспользоваться для изотермальной амплификации уникальным продуктом на рынке - универсальным набором IsoAmp II для термофильной хеликаза-зависимой амплификации (tHDA).

Говоря о продуктах, используемых для проведения изотермальной амплификации, следует отметить также набор для полной амплификации генома клетки SingePlex от New England Biolabs.

При таком разнообразии продуктов, важно понять, в каком случае лучше использовать каждый из ферментов.

Условия многих типов изотермальных экспериментов предусматривают повышенные температуры (> 50°C), и, следовательно, необходимо использовать термофильные ДНК-полимеразы. ДНК-полимераза Bst заполняет нишу между термофильными и мезофильными полимеразами. Оптимум температуры порядка 60-65°C выше, чем у фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I но ниже, чем у VentR ДНК-полимеразы. разброс оптимальных температур у различных ДНК-полимераз дает исследователям больше возможностей для оптимизации соотношения хеликазной активности и условий отжига праймеров. Повышенная температура обеспечивает севенирование в GC-богатых регионах.

Большой фрагмент полимеразы I Bacillus stearothermophilus (Bst ДНК-полимераза, большой фрагмент) очень долгое время оставался лучшим выбором для проведения изотермальной амплификации (оптимум рабочей температуры порядка 65°C). Данный фермент был доработан и усовершенствован и появился под названием Bst 2.0 ДНК-полимераза -это in silico сконструированный гомолог большого фрагмента Bst ДНК-полимеразы.

Обе ДНК-полимеразы могут быть использованы для проведения изотермальной амплификации и для секвенирования ДНК. Bst 2.0 ДНК-полимераза характеризуется увеличением выхода амплификации, большую устойчивость к солям (до 120 mM одновалентной соли), больший диапазон температурного оптимума и увеличенную термостабильность (60–72°C) по сравнению с исходной ДНК-полимеразой. Также Bst 2.0 ДНК-полимераза упрощает вставку dUTP. В то же самое время Bst 2.0 ДНК-полимераза может обеспечить решение всех задач, для которых используется большой фрагмент Bst ДНК-полимеразы.

Для диагностических экспериментов, требующих высокую воспроизводимость, мы рекомендуем использовать Bst 2.0 WarmStart® ДНК-полимеразу.

WarmStart вариант обладает всеми качествами Bst 2.0 ДНК-полимеразы, с дополнительным преимуществом, аналогичным HotStart у обычных ДНК-полимераз. Так, фермент может проявлять нежелательную, не зависящую от матрицы активность при температуре ниже температуры амплификации и эта активность может значительно повлиять на эффективность и на воспроизводимость. Аптамер, входящий в состав Bst 2.0 WarmStart® ДНК-полимеразы, ингибирует активность при температуре ниже 50°C, поэтому реакционная смесь может быть приготовлена при комнатной температуре без опасности прохождения неспецифической реакции. Также в данном случае не требуется отдельный шаг для активации при проведении ПЦР.

Если 5'-3' экзонуклеазная активность более важна, чем хеликазная активность, мы можем предложить использовать полноразмерную Bst ДНК-полимеразу.

Также NEB предлагает ряд ДНК-полимераз, которые сохраняют активность при пониженных температурах. Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I (без 3' - 5' экзонуклеазной активности) и большой фрагмент Bsu ДНК-полимеразы, - оптимальный выбор для решения задач по проведению изотермальной амплификации при температуре 25°C Bsu ДНК-полимераза сохраняет 50% от своей активности при 37°C, что в свою очередь в два раза выше активности фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I.

Кроме вышеперечисленного,большой фрагмент Bsu ДНК-полимеразы используется для случайного мечения праймеров, синтеза второй цепи кДНК, удлинения одного конца цепи при помощи dA и амплификации замещением цепей.

Особенно хочется отметить в нашем обзоре ДНК-полимеразу phi29. Если задачи эксперимента требуют чрезвычайно высокую процессивность, наличие проверяющего экзонуклеазного домена, высокую точность и высокую хеликазную активность - тогда следует остановить свой выбор на этой полимеразе.

Термофильная хеликаза-зависимая амплификация (tHDA)

Термофильная хеликаза-зависимая амплификация (tHDA) - это новый метод изотермальной амплификации нуклеиновых кислот. Так как же при ПЦР, с помощью метода tHDA селективно амплифицируют регион последовательности ДНК, ограниченный парой праймеров. Тем не менее, в отличие от ПЦР, для разделения двуцепочечной ДНК используется фермент с хеликазной активностью вместо нагревания. Это позволяет амплифицировать ДНК без циклической программы нагревания. Такой метод может быть объединен с реакцией обратной транскрипцией при анализе РНК.

Универсальный набор IsoAmp II для термофильной хеликаза-зависимой амплификации (tHDA используется для амплификации и детекции коротких последовательностей ДНК (70-120 п.о.) при постоянной температуре. Набор может быть использован с различными матрицами, включая геномную ДНК микробов, вирусную ДНК, плазмидную ДНК и кДНК. После оптимизации состава праймеров и буферного раствора, при помощи tHDA может быть амплифицирована, и далее обнаружена при помощи электрофореза в агарозе, даже одиночная копия ДНК. Универсальный набор IsoAmp II для термофильной хеликаза-зависимой амплификации позволяет проводить различные типы ПЦР с использованием единого реакционного буфера.

Срок использования набора составляет 6 месяцев при хранении при -20°C и дольше при хранении при 80°C.

Восстановление и амплификация поврежденных образцов ДНК

Иногда для проведения экспериментов приходится использовать образцы поврежденной ДНК. Улучшить качество образцов перед амплификацией, поможет набор PreCR для репарации ДНК. Этот набор поможет восстановить целостность ДНК и исправить такие повреждения как: фрагментация (гидролиз, действие нуклеаз), сшивки между ДНК и протеинами (действие формальдегида), деаминированные цитозины (гидролиз), окисление пиримидинов, окисление гуанина, блокированные 3'-концы, димеры тимидинов (ультрафиолетовая радиация), выщепление одиночных нуклеотидов из последовательности и т.д.

С другой стороны, даже поврежденные образцы ДНК можно амплифицировать, если воспользоваться специально предназначенной для этого Sulfolobus ДНК-полимеразой IV. Эта полимераза с успехом подходит как для устранения повреждений ДНК, так и для амплификации через поврежденные участки.

Включение в цепь ДНК нестандартных нуклеотидов

C использованием Therminator ДНК-полимеразы возможно решить следующие задачи:

  1. провести секвенирование ДНК при частичном замещении на рибонуклеотиды;
  2. провести секвенирование (а также анализ SNP) при помощи дидезоксинуклеотидов;
  3. провести секвенирование (а также анализ SNP) при помощи нуклеотидов, модифицированных ацильными остатками;

Следует однако обратить внимание на то, что при амплификации протяженных участков вам потребуется пристально отнестись к оптимизации условий реакции.

ДНК-полимеразы VentR и Deep VentR ДНК-полимераза

VentR ДНК-полимераза - это высокоточная термостабильная полимераза. Точность ее в 5-15 раз выше чем у Taq, что является результатом 3'→5' экзонуклеазной активности. При этом более чем 90% фермента остаются активными после инкубации в течение 1 часа при 95°C.

Deep VentR ДНК-полимераза - это вторая высокоточная полимераза от компании New England Biolabs. Характеризуется еще больше термостабильностью, чем ДНК-полимераза VentR при температуре 95-100°C.

VentR ДНК-полимераза (без экзонуклеазной активности) получена путем удаления 3´→ 5´ экзонуклеазного домена в составе ДНК-полимеразы VentR . Такой вариант предпочтителен для использования в высокотемпературных реакциях секвенирования с использованием дидезоксинуклеотидов, и для реакции удлинения праймеров. Точность полимеразы ниже, чем у оригинального фермента, и в 2 раза выше, чем у Taq.

Deep VentR ДНК-полимераза (нет экзонуклеазной активности) - это результат модификации ДНК-полимеразы Deep VentR, не обладает 3´→ 5´ экзонуклеазной активностью. Фермент чрезвычайно термостабилен, сохраняя до 50% активности после инкубации в течение 23 ч при 95°C и 8 ч при 100°C.

VentR ДНК-полимераза (без экзонуклеазной активности) и Deep VentR ДНК-полимераза (без экзонуклеазной активности) могут применяться для удлинения праймеров и для секвенирования при температуре 72°C.

Мы надеемся, что представленный обзор будет полезен в ежедневной работе, поможет внедрить результаты новых разработок NEB и улучшить качество ПЦР-экспериментов!

Обратная связь

© 2012-2019 SkyGen
Информация и цены на сайте не являются публичной офертой
На нашем веб-сайте мы используем файлы cookie, которые помогают нам создать максимально удобные для посетителя условия пользования сайтом. Если Вы продолжите использовать сайт, мы будем считать что Вас это устраивает.
ОK