Реактивы и оборудование
для лабораторий
0

#4 xGen Lockdown зонды и панели от IDT сфокусируют ваши исследования в области секвенирования следующего поколения (NGS)

08.09.2014

Несмотря на то, что удешевление стоимости секвенирования ДНК позволило проводить масштабные исследования (1), непомерно высокая стоимость обработки образцов до сих пор является проблемой практически для всех пользователей. Это заставляет все большее количество лабораторий проводить секвенирование только той части генома, которая представляет интерес. Целевое обогащение при помощи гибридного захватывания, которое рассматривается в данном обзоре, реализуется непосредственно перед проведением секвенирования, схема такого обогащения представлена на рис.1. Методы обогащения генома уменьшают стоимость секвенирования и позволяют сфокусировать свои усилия на конкретном участке гена.

Если мы выделим специфический регионе генома, это позволяет секвенировать один участок во множестве образцов одновременно. Благодаря гибридному захватыванию интересующих участков генома и последующему секвенированию возможно проводить эксперименты по генотипированию, идентификацию вариантов сплайсинга, нахождение мест вставки новых или делеции существовавших нуклеотидов, а также изучение геномной рекомбинации и секвенирование сайтов интеграции вирусов и транспозонов.

d4-1-cc-target-enrichment_fig-1_2.png

Рис.1. Целевое захватывание последовательности с помощью xGen Lockdown зондов.

Проведение анализа большого количества целевых участков генома во множестве образцов.

Давайте рассмотрим эксперимент по генотипированию 100 образцов, реализованный при помощи ПЦР, он потребует проведения множества индивидуальных ПЦР-реакций, каждую из которых необходимо будет оптимизировать. Оптимизация и проведение этих реакций потребует большого количества времени и возможность появления ошибок возрастет, из-за того что качество будет зависеть от большого количества индивидуальных реакций. Более того, потребуется большое количестве первоначального материала. В конце концов, генотипирование при помощи ПЦР может не завершиться успешно, если мутации возникают в праймерах. Обычно последовательность праймеров оптимизируется с использованием нескольких образцов, и далее полученные таким путем праймеры используются для амплификации большой совокупности образцов. Такая практика основана на предположении о том, что участки, на которые будут садиться праймеры не претерпевают изменений в составе всей совокупности образцов. Это может оказаться правдой для небольшой серии образцов, но если число реакций увеличивается, то увеличивается и вероятность деформации последовательности сдвигом (рис.2А).

В качестве альтернативы ПЦР, секвенирование NGS после целевого обогащения объединяет все реакции генотипирования и обнаружение мутации в один этап, схема расположения зонда показана на рис.2. При гибридном захватывании последовательности с одиночным нуклеотидным полиморфизмом (SNP) используется зонд, направленный на узнавание последовательности вокруг SNP, и мутация гибридизующейся последовательности, несмотря на неполную комплементарность с зондом не окажет критического воздействия на процесс узнавания. Фактически, зонды xGen Lockdown Probes могут игнорировать до 7 мутаций внутри целевого участка без влияния на эффективность гибридизации. Обогащенная ДНК далее секвенируется в один этап. В таком случае нет необходимости в подборке условий индивидуальных ПЦР и гелей для анализа. Если исследователь решит расширить спектр экспериментов и увеличить количество зондов, направленных на узнавание других SNP, то возможно воспользоваться уже подобранными условиями эксперимента по обогащению и секвенированию.

xGEN_fig2.png

Идентификация сайтов встраивания вирусов и транспозонов

Эксперименты по изучению функций генов часто включают в себя гетеротипическую и экспрессию их последующий нокдаун при помощи интерференцией РНК (RNAi). Ретровирусы используются для введения экзогенной ДНК в геном изучаемых организмов. Фрагмент ДНК может быть интегрирован в безопасный участок между генами или в транскрибируемый участок (2) который может варьировать функцию генов, и вызываемые этим ложные фенотипы. Для исследования проблемного сайта встраивания во множестве различных образцов, возможно проводить целевое обогащение с использованием гибридизации зондов с известными участками экзогенной последовательности ДНК (рис.3). Таким образом, образцы, в которых произошло встраивание экзогенной ДНК могут быть отобраны для дальнейшего изучения.

xGEN_fig3.png

Методика также важна для изучения сайтов интеграции транспозонов и инфицирующих вирусов. Информация о молекулярном механизме встраивания может улучшить понимание разработки лекарств для соответствующих заболеваний, а также быть полезной для решения других задач. Идентификация вирусной ДНК в изучаемом организме также используется для диагностирования стадии заболевания (3). проведение секвенирования ДНК человека, после целевого обогащения участками вирусного генома может подтвердить факт инфицирования.

Изучение альтернативного сплайсинга

Альтернативный сплайсинг наблюдается в 95% генах человека, которые имеют более чем 1 экзон, а ошибки во время этого процесса ассоциированы со множеством болезней (4). Некоторые из таких болезней могут быть диагностированы с помощью нахождения генов, которые альтернативно участвуют в сплайсинге. Для этого может использоваться, например, секвенирования следующего поколения РНК (NGS). Получаемая информация позволяет проанализировать количество РНК, представленной в определенный момент времени, и таким образом, этот метод чувствителен к различиям в генной экспрессии. РНК, полученная из образца, конвертируют в ДНК, и далее проводится стандартная процедура секвенирования ДНК. Для того чтобы облегчить определение малые количества вариантов сплайсинга, которые ассоциированы с заболеваниями, зонды, специфичные к изучаемому транскрипту могут использоваться для обогащения, облегчая обнаружение таких транскриптов (Рис.4). Также, различные изоформы протеинов детектируются в пропорции образца, и оставшиеся образцы могут быть легко проверены на наличие транскриптов альтернативного сплайсинга, по сравнению с изучением экспрессированных протеинов при помощи Western Blot.

xGEN_fig4_3.png

Гибридное связывание увеличивает универсальность экспериментов

Секвенирование следующего поколения, проводимое после этапа целевого обогащения, позволяет исследовать один и тот же образец для решения нескольких задач одновременно, а также упрощается процесс увеличения количества целевых последовательностей. Такая простота расширения количества обогащаемых участков позволит добавить новый участок SNP, информация о котором появилась в печати - для этого к существующей панели зондов добавляется еще несколько, и ее можно использовать для последующих экспериментов по генотипированию. Добавление дополнительного зонда никак не скажется на эффективности работы существовавшей ранее панели, но позволит получать большее количество информации в результате каждого эксперимента. Таким образом возможно более оперативно реагировать на появляющиеся каждый день публикации в сфере NGS.

Прочитав большую часть данного обзора, и узнав обо всех дополнительных возможностях метода, кроме того что он фокусирует эксперименты по секвенированию, Вы задаетесь следующим вопросом: Упростит ли гибридное связывание постановку экспериментов?

Хотя гибридное связывание может быть использовано для решения большого количества задач, иногда этот метод может и не являться наиболее подходящим для всех исследователей. Например, процент прочтений последовательности, полученный от определенного региона увеличивается одновременно с увеличением количества зондов. Панели из большего количества зондов, как правило, более эффективны (в том числе и с точки зрения цены). Маленькие панели зондов используются для изучения ретровирусов и транспозонов; Тем не менее, следует обращать внимание на то, что результаты с использованием разных панелей и разных методов для обогащения могут разниться. Например, повторяемые участки будут захватываться с большей частотой.

В то же время следует понимать, что если задачей является изучение одного целевого участка в тысяче различных образцов, то лучше использовать метод обогащения при помощи ПЦР. xGen Lockdown зонды - изготавливаются полностью на заказ, из которых могут быть использованы для создания захватывающих панелей любого размера.

Зонды xGen Lockdown Probes от IDT

Зонды xGen Lockdown Probes - это индивидуально синтезируемые зонды для целевого обогащения при помощи гибридного связывания. Этот продукт был разработан специально для совместного применения с NGS секвениварония. Зонды могут быть использованы индивидуально для создания панелей, которые могут быть оптимизированы, расширены, комбинированы с другими панелями при необходимости. Также отдельные зонды могут быть добавлены в уже существующие панели для улучшения узнавания труднодоступных участков (например GC-богатых участков).

Кроме того, возможно выбрать одно из готовых решений от IDT - одну из готовых панелей:

xGen Inherited Diseases Panel - панель для обогащения генов, ассоциированных с наследственными заболеваниями, содержит 116 355 зондов, нацеленных на узнавание 4503 генов и 80 однонуклеотидных полиморфизмов (SNPs), сцепленных с наследственными заболеваниями.

xGen Acute Myeloid Leukemia Cancer Panel v1.0 - панель для обогащения более чем 260 генов ассоциированных с развитием острой миелоидной лейкемии (AML), содержит 11 743 индивидуально синтезированных зондов.

xGen Pan-Cancer Panel v1.5 - панель для обогащения генов, ассоциированных с 12 типами раковых заболеваний, состоит из 7 816 индивидуальных синтезированных зондов, которые обеспечивают обогащение более чем 127 генов.

Обеспечение совместимости с популярными платформами NGS

В процессе обогащения используются блокирующие олигонуклеотиды xGen Blocking Oligos для адаптеров в составе последовательностей библиотек. Такие блокирующие олигонуклеотиды уменьшают неспецифичное связывание и увеличивают эффективность обогащения.

xGenUniversal Blocking Oligos совместимы с Illumina TruSeq и другими Single-Index адаптерами, с Illumina TruSeq HT и другими Dual-Index адаптерами, а также с Ion Torrent Barcoded адаптерами.

xGen Standard Blocking Oligos совместимы с Illumina TruSeq, и другими Single-Index адаптерами, с Illumina TruSeq HT и другими Dual-Index адаптерами, а также с Ion Torrent Barcoded адаптерами и адаптерами Roche/454.

Возможно также производство блокирующих олигонуклеотидов на заказ (xGen Custom Blocking Oligos).

Использованная литература

  1. Hayden EC (2013) Gene sequencing leaves the laboratory. Nature 494(7437):290-291.
  2. Ambrosi A, Cattoglio C, Di Serio C. (2008) Retroviral integration process in the human genome: is it really non-random? A new statistical approach. PLoS Comput Biol 4(8):e1000144.
  3. Depledge DP, Palser AL, et al. (2011) Specific capture and whole-genome sequencing of viruses from clinical samples. PLoS ONE 6(11): e27805.
  4. Matlin AJ, Clark F, Smith CW. (2005) Understanding alternative splicing: towards a cellular code. Nat Rev Mol Cell Biol, 6(5):386–398.
  5. Cancer Genome Atlas Research Network. (2013) Genomic and epigenomic landscapes of adult _de novo_ acute myeloid leukemia. N Engl J Med, 368(22):2059–2074.

По всем вопросам подбора Вашей индивидуально панели для обогащения перед секвенированием NGS обращайтесь в СкайДжин, которая является официальным дистрибьютором IDTDNA в России!

Для обзора использовалась информация из статьи Target Enrichment Facilitates Focused Next Generation Sequencing

Обратная связь

© 2012-2019 SkyGen
Информация и цены на сайте не являются публичной офертой
Изготовление сайта – НБС-Медиа
На нашем веб-сайте мы используем файлы cookie, которые помогают нам создать максимально удобные для посетителя условия пользования сайтом. Если Вы продолжите использовать сайт, мы будем считать что Вас это устраивает. ОK