#47 Готовим библиотеки РНК с новыми наборами NEBNext Ultra II RNA Kit

Вам нужны хорошие чувствительность и специфичность в ваших экспериментах RNA-seq? У вас всегда малое количество РНК на входе? Мы также озадачились решением этой проблемы и решили разузнать, что всё-таки сможет помочь нам для получения хороших библиотек.

Мы сразу обратились к New England Biolabs. Чтобы решить эти проблемы, NEB разработал новое поколение наборов для подготовки библиотек РНК. Новый протокол позволяет получить стабильно высокий выход библиотек, работая при этом с малым количеством РНК и сниженным числом циклов ПЦР.

Новые наборы серии NEBNext Ultra II RNA имеют упрощенный протокол работы и доступны для направленной (стрэнд-специфичной, с использованием «dUTP метода») и ненаправленной подготовки библиотеки, с возможностью выбора наборов с частицами SPRISelect® для этапов  «size-selection» и очистки.

Зачем использовать набор NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit?

•   Готовить высококачественные библиотеки даже из малых количеств РНК:

•     5 нг – 1 мкг тотальной РНК (протокол poly(A) mRNA)

•    10 нг – 1 мкг тотальной РНК (протокол rRNA depletion workflow)

•  Минимизировать биас ПЦР и проводить ПЦР только с несколькими циклами.

•  Повысить специфичность библиотек и покрытие транскриптов.

•  Максимизировать гибкость протокола, заказывая только те компоненты, которые действительно вам нужны, включая ненаправленную и стрэнд-специфичную пробоподготовку, удаление рРНК, реагенты для обогащения поли(А)+ мРНК, а также адаптеры и индексы (12 или 96 индексов), продаваемые отдельно.

• Наслаждаться надежностью «золотого стандарта сайз-селекшн» SPRIselect и магнитных частиц для очистки, поставляемых сразу в наборе.

•  Экономить время с оптимизированным протоколом работы, сокращая время ручной работы.

•  Иметь надежные показатели работы даже с РНК низкого качества, включая FFPE образцы.

Вам нужна ненаправленная подготовка библиотек?

Чтобы удостовериться в качестве работы новых наборов, мы решили посмотреть экспериментальные данные работы NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit, которые предоставили нам разработчики.

 1. NEBNext® Ultra II RNA Library Prep (ненаправленная) увеличивает выход библиотек

 Выход библиотек является одним из важных показателей успеха подготовки библиотеки, а пересмотр каждого этапа в рабочем процессе подготовки библиотеки РНК позволяет значительно повысить выход с помощью набора NEBNext Ultra II RNA Library Prep по сравнению с более ранними наборами NEBNext, а также с другими коммерчески доступными наборами. Особенно сложным может быть достижение достаточного выхода при малом входном количестве РНК. Тем не менее, протокол NEBNext Ultra II эффективно решает эти проблемы, в том числе с использованием поли(A)+ мРНК-обогащения или удаления рРНК. Кроме того, образцы с низким качеством, такие как РНК из FFPE образцов, также могут быть успешно использованы в ваших исследованиях, особенно в сочетании с набором NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat).

Высокий выход библиотек из широкого диапазона входных количеств РНК

NEBNext Ultra II RNA обеспечивает самый высокий выход библиотек

Поли(А)-содержащую мРНК выделяли из контрольного образца Human Universal Reference RNA (Agilent # 740000). Библиотеки были получены с использованием наборов NEBNext Ultra II RNA Kit (с модулем для изоляции мРНК NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module) и Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit v2. Отображаются входная РНК и количество циклов ПЦР. Показан средний выход библиотек по трем повторам.

2. NEBNext® Ultra™ II RNA Library Prep (non-directional) Generating High-quality Libraries

 Хотя для успешных результатов секвенирования требуется хороший выход библиотеки, одного ее количества недостаточно. Качество библиотеки также является критичным параметром, независимо от количества стартового материала, качества или содержания GC в образце РНК. Высококачественная библиотека будет иметь однородное представление всей интересующей РНК, минимальные уровни рибосомной РНК и высокую стрэнд-специфичность. В результате секвенирования такой библиотеки мы добьёмся отличного покрытия всех транскриптов.

Равномерное покрытие вне зависимости от GC-состава

Высококачественная библиотека будет иметь однородное покрытие исходного образца, включая равномерное покрытие по GC составу, независимо от входного количества образца. При малом количестве образца РНК требуется большее число циклов ПЦР, что может привести к биасу, включая GC биас. Повышенная эффективность протокола работы Ultra II RNA позволяет уменьшить количество циклов ПЦР. Это в сочетании с использованием Q5 High-Fidelity ДНК-полимеразы для амплификации библиотек обеспечивает превосходное покрытие транскриптов.

Пробоподготовка NEBNext Ultra II RNA обеспечивает равномерное покрытие вне зависимости от содержания GC в широком диапазоне количеств стартового материала.

Поли(А)-содержащую мРНК выделяли из контрольного образца Human Universal Reference RNA (Agilent # 740000). Библиотеки были получены с использованием наборов NEBNext Ultra II RNA Kit (с модулем для изоляции мРНК NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module) и Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit v2. Указано количество стартовой РНК. Библиотеки были секвенированы на Illumina® NextSeq® 500 в режиме парно-концевого чтения (2×76 п.о.). Чтения были картированы с референсным геномом hg19 с использованием Hisat 2.0.3. Распределение GC содержимого для каждой библиотеки вычислялось с использованием инструмента read_GC.py из RSeQC.

Рибосомная РНК была удалена из 1 мкг, 100 нг и 5 нг контрольного образца Human Universal Reference RNA (Agilent # 740000) с использованием наборов NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) или Illumina Ribo-Zero™ Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat). Образец 5 нг был проанализирован только с наборами NEBNext. Затем библиотеки были подготовлены с использованием наборов NEBNext Ultra II RNA Kit или Illumina TruSeq RNA Library Prep Kit v2 соответственно. Библиотеки были секвенированы на Illumina NextSeq® 500 в режиме парно-концевого чтения (2×76 п.о.). Чтения были картированы с референсным геномом hg19. Распределение GC содержимого для каждой библиотеки вычислялось с использованием картированных чтений. Библиотеки Ultra II RNA имели однородное распределение по содержанию GC в пределах диапазона стартовых количеств РНК.

Минимизация уровня дупликации

Уровень дупликации (процент чтения последовательностей из-за дубликатов ПЦР) может повышаться, когда библиотеки теряют однородность и приготовлены с большим числом циклов ПЦР. Каждый этап протокола подготовки библиотек Ultra II RNA оптимизирован и требует меньшего числа циклов ПЦР, что увеличивают однородность библиотек и минимизируют уровни дупликации.

 NEBNext Ultra II RNA вместе с NEBNext rRNA Depletion kit позволяет получить наилучший результат и приводит к более низкому уровню дупликации.

Рибосомная РНК была удалена из 1 мкг, 100 нг и 5 нг контрольного образца Human Universal Reference RNA (Agilent # 740000) с использованием наборов NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) или Illumina Ribo-Zero™ Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat). Затем библиотеки были подготовлены с использованием наборов NEBNext Ultra II RNA Kit или Illumina TruSeq RNA Library Prep Kit v2 соответственно. Образец 5 нг был проанализирован только с наборами NEBNext. Библиотеки были секвенированы на Illumina NextSeq® 500 в режиме парно-концевого чтения (2×76 п.о.). Чтения были сэмплированы до 10 миллионов прочитанных пар и сопоставлены с референсным геномом hg19.

 Содержание рибосомной РНК

Поскольку большинство (>90%) РНК в образце может быть рибосомной РНК (рРНК), ее необходимо удалить до подготовки библиотеки. Когда наш интерес представляет только мРНК, а образец представляет собой высококачественную эукариотическую РНК, то предпочтительным методом является обогащение интактных поли(А)+ мРНК с помощью олиго-dT зондов.

В случае, когда качество образца низкое (и, следовательно, поли(А)-хвосты могут быть деградированы) или наш образец не является эукариотическим, интересующая нас мРНК выходит за пределы пула поли(А)-содержащих мРНК, может быть применен протокол удаления рРНК.

Набор NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit совместим с протоколами обогащения поли(А)+ мРНК и удаления рРНК. При этом библиотеки могут быть подготовлены всего лишь из 10 нг тотальной РНК (при обогащении поли(А)+ мРНК) или 5 нг тотальной РНК (по протоколу удаления рРНК). Эффективное удаление рРНК достигается с использованием обоих протоколов.

NEBNext Ultra II с модулем для обогащения поли(А)+ мРНК NEBNext позволяет эффективно удалять рРНК.

Поли(А)-содержащую мРНК выделяли из контрольного образца Human Universal Reference RNA (Agilent # 740000). Библиотеки были получены с использованием наборов NEBNext Ultra II RNA Kit (с модулем для изоляции мРНК NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module) и Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit v2. Указано количество стартовой РНК. Библиотеки были секвенированы на Illumina® NextSeq® 500 в режиме парно-концевого чтения (2×76 п.о.). Прочитанные риды оценивались как рибосомные, если они содержали 6 или более 32 п.о., совпадающих с последовательностями 18S, 28S, 5S, 5.8S, 16S или 12S человеческой рРНК (mirabait 4.9). Процент оставшейся рРНК вычисляли путем деления прочтенных рРНК на общее число прочтений, прошедших фильтрацию по качеству. Процент оставшейся рРНК показан в среднем из трех повторов. Протокол Ultra II RNA более эффективен при удалении рРНК из общего образца РНК, что приводит к наилучшему покрытию поли(А)+ транскриптома.

  Пробоподготовка NEBNext Ultra II RNA с модулем NEBNext rRNA Depletion реально снижает количество рибосомной РНК в образце

Рибосомная РНК была удалена из 1 мкг, 100 нг и 5 нг контрольного образца Human Universal Reference RNA (Agilent # 740000) с использованием набора NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) или набора Illumina Ribo-Zero™ Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat). Затем библиотеки были подготовлены с использованием наборов NEBNext Ultra II RNA Kit или Illumina TruSeq RNA Library Prep Kit v2 соответственно. Количество 5 нг было протестирован только с наборами NEBNext. Библиотеки были секвенированы на Illumina NextSeq® 500 в режиме парно-концевого чтения (2×76 п.о.). Прочитанные риды оценивались как рибосомные, если они содержали 6 или более 32 п.о., совпадающих с последовательностями 18S, 28S, 5S, 5.8S, 16S или 12S человеческой рРНК (mirabait 4.9). Процент оставшейся рРНК вычисляли путем деления прочтенных рРНК на общее число прочтений, прошедших фильтрацию по качеству. Процент оставшейся рРНК показан в среднем из трех повторов.

 3. Протокол NEBNext® Ultra™ II RNA Library Prep (non-directional) повышает специфичность библиотек

В идеале библиотека должна содержать все присутствующие транскрипты и соответствовать последовательностям начальной интересующей РНК. Когда подготовка библиотеки неэффективна или в случае малого количество образца, существует риск того, что в полученной библиотеке некоторые последовательности будут чрезмерно представлены или вообще отсутствовать.

Мы обратили внимание на данные корреляционного анализа, который показал, что библиотеки NEBNext Ultra II сохраняют специфичность даже при малых количествах образца.

 Библиотеки демонстрируют превосходную специфичность при разном количестве РНК

Низкие количества библиотек NEBNext Ultra II RNA сохраняют свою специфичность

Поли(А)-содержащую мРНК выделяли из контрольного образца Human Universal Reference RNA (Agilent # 740000). Библиотеки были получены с использованием наборов NEBNext Ultra II RNA Kit (с модулем для изоляции мРНК NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module) и Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit v2. Для мэппинга всех GENCODE v25 транскриптов и количественной оценки использовался Salmon 0.4.0. TPM = Transcript Per Kilobase Million. На графике показаны значения R2. Для каждого случая нижние графики показывают диапазон 0-1000 TPM. Корреляционный анализ транскриптов указывает на очень хорошую корреляцию между различными количествами входной РНК.

  Данные анализа транскриптов ERCC

Поли(А)-содержащую мРНК выделяли из контрольного образца Human Universal Reference RNA (Agilent # 740000) с рекомендованным количеством ERCC RNA Spike-In Mix I (Thermo Fisher Scientific #4456740). Библиотеки были получены с использованием наборов NEBNext Ultra II RNA Kit (с модулем для изоляции мРНК NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module) и Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit v2. Для мэппинга всех транскриптов и количественной оценки использовался Salmon 0.6. TPM = Transcript Per Kilobase Million. На графике показаны значения R2. Корреляционный анализ транскриптов указывает на очень хорошую корреляцию между различными количествами входной ERCC spike-ins.

Низкие количества библиотек NEBNext Ultra II RNA сохраняют свою специфичность даже при низких входных количествах

Рибосомная РНК была удалена из 1 мкг, 100 нг и 5 нг контрольного образца Human Universal Reference RNA (Agilent # 740000) с рекомендованным количеством ERCC RNA Spike-In Mix I (Thermo Fisher Scientific #4456740) и набора NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat). Затем библиотеки были подготовлены с использованием наборов NEBNext Ultra II RNA Kit. Далее библиотеки секвенировались на Illumina NextSeq® 500 с использованием парно-концевого чтения (2×76 п.о.). Для мэппинга всех ERCC транскриптов и количественной оценки использовался Salmon 0.4.0. TPM = Transcript Per Kilobase Million. На графике показаны значения R2. Корреляционный анализ TPM указывает на очень хорошую корреляцию между различными количествами библиотек Ultra II RNA (A), включая ERCC транскрипты (B).

  

4. Ненаправленная пробоподготовка NEBNext® Ultra™ II RNA Library Prep максимизирует покрытие                

В идеале библиотека должна включать полностью каждый транскрипт от 5' до 3'-конца. Если протокол пробоподготовки не оптимизирован, то может иметь место неполное покрытие транскриптов, особенно при использовании низких количеств стартовой РНК или некачественной РНК.

Библиотеки NEBNext Ultra II RNA обеспечивают равномерное покрытие по всему пулу транскриптов

Поли(А)-содержащую мРНК выделяли из контрольного образца Human Universal Reference RNA (Agilent # 740000). Библиотеки были получены с использованием наборов NEBNext Ultra II RNA Kit (с модулем для изоляции мРНК NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module) и Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit v2. Начальное количество РНУ указано на графике. Далее библиотеки секвенировались на Illumina NextSeq® 500 с использованием парно-концевого чтения (2×76 п.о.). Этот график отображает эффективность покрытия транскриптов RefSeq в библиотеках Ultra II RNA при снижении количества РНК от 1 мкг до 10 нг. Изменения, очевидные с набором TruSeq, являются результатом потери покрытия на 3'-конце некоторых транскриптов.

Библиотеки NEBNext Ultra II RNA обеспечивают равномерное покрытие по всем транскриптам

Рибосомная РНК была удалена из 1 мкг, 100 нг и 5 нг контрольного образца Human Universal Reference RNA (Agilent # 740000) с использованием наборов NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) или Illumina Ribo-Zero™ Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat). Затем библиотеки были подготовлены с использованием наборов NEBNext Ultra II RNA Kit или Illumina TruSeq RNA Library Prep Kit v2, соответственно. Образец 5 нг был проанализирован только с наборами NEBNext. Далее библиотеки секвенировались на Illumina NextSeq® 500 с использованием парно-концевого чтения (2×76 п.о.). Этот график показывает эффективность покрытия транскриптов для разных количеств стартовой РНК – от 1 мкг до 5 нг.

 Однородность покрытия транскриптов ERCC-00004 и ERCC-00074

Рибосомная РНК была удалена из контрольного образца Human Universal Reference RNA (Agilent # 740000) с рекомендованным количеством ERCC RNA Spike-In Mix I (Thermo Fisher Scientific #4456740) и использования набора NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat). Затем библиотеки были подготовлены с использованием набора NEBNext Ultra II RNA Kit. Библиотеки секвенировались на Illumina NextSeq® 500 с использованием парно-концевого чтения (2×76 п.о.). Библиотеки, подготовленные с использованием набора NEBNext Ultra II RNA Kit, обеспечили хорошее покрытие транскриптов вне зависимости от количества стартового материала.

Информация для заказа:

Набор NEBNext Ultra II Directional для приготовления библиотек РНК для платформы Illumina	E7760S
	E7760L
Набор NEBNext Ultra II Directional для приготовления библиотек РНК для платформы Illumina с частицами для очистки	E7765S
	E7765L
Набор NEBNext Ultra II для приготовления библиотек РНК для платформы Illumina	E7770S
	E7770L
Набор NEBNext Ultra II для приготовления библиотек РНК для платформы Illumina с частицами для очистки	E7774S
	E7775L
Модуль для синтеза первой цепи РНК NEBNext Ultra II	E7771S
	E7771L
Набор для деплеции рРНК с магнитными частицами NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)	E6350S
	E6350L
	E6350X
Модуль NEBNext® для выделения поли(А)+ мРНК с магнитными частицами	E7490S
	E7490L