#3 Красивое совместное решение от New England Biolabs и IDT DNA для введения фрагмента гена в плазмидный вектор

Мы всегда рады, когда узнаем об удобных, красивых, а главное, эффективных решениях, реализованных с использованием продуктов New England Biolabs и Integrated DNA Technologies руками наших клиентов. Сегодня мы хотели бы рассказать о методике сборки уникальной последовательности плазмидного вектора, которую применяют в своих исследованиях лаборатории из Новосибирска и Калининграда. Задачей было получить плазмидный вектор, содержащий несколько функциональных элементов, располагающихся в строго определенной последовательности. Плазмидный вектор должен был кодировать нуклеазу Cas9, специфично проникающую в митохондрии клеток человека для редактирования митохондриального генома. В руках исследователей была схема эксперимента, а также возможность воспользоваться лучшими решениями компаний NEB&IDT. Давайте посмотрим, как это было реализовано на практике!

На первом этапе перед сотрудниками сектора клеточных технологий Института цитологии и генетики СО РАН и сотрудниками лаборатории молекулярно-генетических технологий Балтийского федерального университета им. И. Канта стояла задача по сборке протяженной последовательности ДНК, содержащей функциональные элементы, не встречающиеся в нужном порядке в коммерчески доступных плазмидных векторах. Причем собрать эти элементы воедино с помощью классических методов молекулярного клонирования было достаточно проблематичным.

В качестве примера мы приводим структуру одного из такие фрагментов. Это последовательности, кодирующие: промотор цитомегаловируса, митохондриальный сигнальный пептид, последовательность FLAG для иммуноцитохимической детекции, и нуклеаза Cas9, располагающиеся друг за другом встык. Изначально, дизайн плазмидного вектора был разработан в программном обеспечении SnapGene (http://www.snapgene.com/).

Нуклеотидную последовательность фрагмента вектора вы можете увидеть в любезно предоставленном скриншоте. Фрагмент, содержащий нужные последовательности, расположенные встык, на рисунке выделен оранжевым цветом.

После того, как исследователи определились с нуклеотидной последовательностью, предстояло осуществить ее синтез. Мы остановимся на двух вариантах решения этой задачи. Первое решение: предлагалось «разбить» данную последовательность на олигонуклеотиды длиной 60 оснований с перекрытием 20 оснований. Протокол такого решения опубликован Даниелем Гибсоном (Gibson 2011 - документ можно скачать как приложение в данному обзору) и может быть выполнен при помощи набора для лигирования Gibson Asembly Kit (New England Biolabs).

Другим решением является заказ нужного фрагмента в готовом виде в компании IDT. Данный продукт называется gBlocks. Говоря о gBlocks от IDT- необходимо понимать, что это двухцепочечные последовательности ДНК длиной до 2000 пар оснований, которые поставляются компанией IDT, готовые к дальнейшему использованию, как в виде фрагментов ДНК, так и в составе плазмидного вектора с выбранными по Вашему усмотрению сайтами рестрикции на 3’ и 5’ концах.

Скриншот фрагмента ДНК, содержащего функциональные блоки в требуемом взаиморасположении.

В конкретно приведенном примере исследователям требовалось собрать воедино три фрагмента:

1. Фрагмент, содержащий энхансер и промотор цитомегаловируса, клонированный из коммерческого плазмидного вектора pTurboGFP-Mito (Евроген).
2. gBlock, содержащий промотор цитомегаловируса, митохондриальный сигнальный пептид, последовательность FLAG для иммуноцитохимической детекции, и нуклеазу Cas9.
3. Фрагмент, содержащий последовательность, кодирующую нуклеазу Cas9, клонированный из плазмидного вектора hCas9 (Addgene).

Для бесшовного соединения трех вышеописанных фрагментов, каждый из них был амплифицирован с использованием олигонуклеотидных праймеров, содержащих в своей последовательности дезоксиурацил (dU). Праймеры подбирались таким образом, что их «хвосты» перекрываются, начиная с dU. Компания IDT предлагает синтез таких праймеров. Условия амплификации со специфичными праймерами лучше предусмотреть заранее - например, в рассматриваемом случае наилучшие результаты показала ДНК-полимераза PfuTurbo Cx (Agilent Technologies).

Полученные ампликоны обрабатывались ферментом USER (New England Biolabs): смесью урацил-ДНК-гликозилазы, которая удаляет урацил из ампликона, формируя AP-сайт и эндонуклеазы VIII, которая удаляет нуклеотиды от AP-сайта в сторону 5΄-конца, формируя липкие концы (структура праймеров представлена на рисунке). Затем липкие концы, имеющие уникальную последовательность, лигируются друг с другом.

В оригинальной работе исследователей из Новосибирска и Калининграда был собран плазмидный вектор из 8 фрагментов в ходе одной реакции лигирования: 4 фрагмента амплифицировали из коммерчески доступных плазмидных векторов, а 4 – заказывали в виде gBlock в IDT.

Все описанные стадии наглядно представлены на следующем рисунке:

Давайте теперь подробнее остановимся на продуктах IDT, использовавшихся в предложенном решении. gBlocks - фрагменты гена на заказ, с адекватной ценой, сиквенс их строго контролируется, и точность синтеза - самая высокая из доступных на сегодняшний день на рынке.

После того, как Вы получили Ваш фрагмент gBlocks, возможно ввести его в требуемую плазмиду как при помощи клонирования по тупым концам, липким концами (в таком случае надо предусмотреть сайты рестрикции в вашем gBlock), так и используя метод клонирования Gibson Assembly. Кроме gBlock - IDT дает возможность заказать необходимый фрагмент гена уже встроенный в плазмиду, при этом на оба конца встроенного гена возможно включить разные сайты рестрикции. Чтобы заказать как просто фрагмент гена, так и встроенный в вектор ген, обратитесь к нам по адресу info@skygen.com, и мы с удовольствием поможем Вам сделать Ваш эксперимент проще и быстрее!

Мы искренне надеемся, что представленная нами в данном обзоре информация поможет Вам в Вашей повседневной работе и привнесет новые идеи!