#36 Отзывы о продукции СкайДжин: амплификация длинных фрагментов, и обратная транскрипция с реагентами от New England Biolabs

03.02.2016

Мы поделились бесплатными образцами ДНК-полимеразы LongAmp (M0323S), а также обратной транскриптазы Protoscript II (M0368S) от New England Biolabs, получили отзывы о работе с ферментами и сегодня рады поделиться этой информацией с вами сегодня! При электрофорезе использовался маркер Quick-Load Purple 2-Log DNA Ladder (0.1 - 10.0 kb) (New England BioLabs, арт. N0550G)

1.Определение последовательности геномной РНК неизвестного штамма вируса калицивириоза кошек с использованием ProtoScript II Reverse Transcriptase и LongAmp Hot Start Taq ДНК-полимераза.

Реагенты для синтеза первой цепи кДНК: ProtoScript II обратная транскриптаза (M-MuLV), арт. M0368S, New England Biolabs, 1× ProtoScript II буфер для обратной транскрипции: 50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, pH 8.3. Гено-специфический праймер: FCV-inner-R, 23 нуклеотидный образец РНК - Feline Calicivirus RNA (#4.2 образец - 368.5 нг/μl)

1. Добавьте следующие компоненты смеси:

	x1
ddH2O (без нуклеаз)	6
Праймер (1uL)	1
10mM dNTPs	1
РНК, 2 ug	5
	13 uL

2. Нагреть смесь до 65°С в течение 5 мин и инкубировать на льду по крайней мере 1 мин.

3. Добавить обратную транскриптазу ProtoScript II:

	x1
Предыдущая смесь	13 uL
5x буфер для первой цепи	4 uL
0.1 M DTT	1
Ингибитор РНКазы RNase Out	1
Обратная транскриптаза Protoscript II	2*
	21 uL

* - Если длина генерируемой кДНК больше чем 5000 п.о.

4. Смешать пипетированием

5. Инкубировать:

42°С / 60 мин
65°С / 20 мин
4°С / ∞

Запланировать опыт так, чтобы эксперименты с использованием обратной транскриптазы Protoscript II и с альтернативным ферментом.

№ ПЦР ячейки	Заметка
1.	Другая обратная транскриптаза
2.	Обратная транскриптаза Protoscript II

Праймеры для ПЦР:

T7-FCV-F + FCV-inner-R => ~ 5000 п.о.,

GC-содержание ПЦР-продукта: ~44%

Реагенты:

ДНК-полимераза LongAmp Hot Start Taq, арт. M0543S, New England Biolabs

	x1
ddH20	30.5
5X LongAmp буфер	10
10 uL праймера #1	2
10 uL праймера #2	2
Образец кДНК	2
10 mM dNTPs	1.5
LongAmp Hot Start Taq ДНК-полимераза (2U/uL)	2
	20 uL

Режим амплификации:

94°С / 30 сек
94°С / 30 сек // 58°С / 60 сек // 65°С / 6.5 мин – 35 циклов
65°С / 10 мин
4°С / ∞

На рис 2, 1 – ПЦР-продукты из кДНК( другая обратная транскриптаза), 2 – ПЦР-продукты из кДНК (ProtoScript II обратная транскриптаза).

Рис.2. 1× TAE, 1% агароза, EtBr. Quick-Load Purple 2-Log DNA Ladder (0.1 - 10.0 kb) (New England BioLabs, арт. N0550G) (5 μl). ПЦР-продукты с загрузочным буфером без красителя (5uL). 100 В.

Далее фрагменты ДНК вырезались из геля. Очистка фрагментов ДНК с использованием набора для экстракции из геля GeneJET (Thermo Scientific, #K0692). Клонирование в pGEM-T Easy vector. Полученный фрагмент был заклонирован, отсеквенирован и выравнен на один из вариантов генома вируса калицивироза кошек из базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Feline+calicivirus) (рис.3.)

Рис.3. Выравнивание в базе данных NCBI (см.выше).

2. Амплификация длинных фрагментов с геномной ДНК Drosophila melanogaster

Для амплификации фрагмента геномной ДНК (9000 b.p.) использовали LongAmp Hot Start Taq DNA Polymerase (NEB) и кит для LongPCR другого производителя. В случае использования LongAmp Hot Start Taq DNA Polymerase (NEB) количество требуемого продукта было в разы больше, чем при использовании полимеразы другого производителя.

Обзорянв.png

Рис.1. 1× TAE, 1% агароза, EtBr. GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (5 μl), ПЦР-продукты: 1 - LR-Taq ДНК-полимераза (5 μl); 2 - LongAmp Hot Start Taq ДНК-полимераза, арт. M0543S, New England Biolabs (1 μl). 100 V.

Мы надеемся, что наши сегодняшние отзывы помогут вам в планировании ваших будущих экспериментов.