#2 Новые высокоточные ДНК-полимеразы Q5 High-Fidelity и Q5 Hot Start High-Fidelity - преимущества для Вашей лаборатории

Эффективная и надежная ДНК-полимераза зачастую является одним из важных условий получения достоверных научных результатов. На казалось бы простом и рутинном этапе амплификации образцов ДНК особенно важно отсутствие проблем и сбоев.

В России ДНК-полимераза Q5 HF уже заслужила самые высокие оценки от исследователей различных научных лабораторий: например Лаборатории сравнительной и функциональной геномики ИБХ РАН, Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск), а также группы разработки новых методов исследования ВИЧ-инфекции и вирусных гепатитов ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

ДНК-полимеразы Q5 High-Fidelity и Q5 Hot Start High-Fidelity, производимые New England Biolabs обладают самой высокой точностью, доступной на сегодняшний день (которая более чем в 100 раз выше чем у ДНК-полимеразы Taq). Благодаря наличию в структуре полимераз уникального домена Sso7d увеличивается процессивность полимераз, скорость, точность и надежность работы. В таблице представлено сравнение основных характеристик некоторых высокоточных полимераз

Видно, что благодаря наличию домена Sso7d полимераза Q5 High-Fidelity способна обрабатывать 1000 нуклеотидных звеньев за 10 секунд работы. Могут быть с высокой надежностью амплифицированы образцы матриц длиной до 20 тысяч пар нуклеотидов для простых, и до 10 тысяч пар нуклеотидов для сложных образцов. ДНК-полимеразу Q5 High-Fidelity возможно успешно использовать для широкого спектра образцов (как содержащих повышенную концентрацию АТ, так и повышенную концентрацию GC). В повседневной работе особенно важно, что высокий выход и минимальная степень ошибок достигаются при минимальном подборе условий.

ДНК-полимераза Q5 Hot Start High-Fidelity обладает дополнительным синтетическим аптамером, который связывается с полимеразой при помощи нековалентных взаимодействий. Таким образом стартовый механизм не требует денатурации на первоначальном этапе, и Q5 Hot Start High-Fidelity ДНК-полимераза, активируясь при комнатной температуре, обеспечивает нормальное проведение циклической реакции. Исчезает необходимость в высокотемпературном этапе активации, что сокращает время и упрощает эксперимент. Данная полимераза - идеальный выбор для ПЦР реакции с особыми требованиями к безошибочности копирования.

Результаты использования полимераз Q5 High-Fidelity и Q5 Hot Start High-Fidelity для копирования образцов с различным содержанием GC представлены на рисунке.

Рис.1. Копирование различных образцов генома человека с различным содержанием GC при помощи Q5 High-Fidelity (А) и Q5 Hot Start High-Fidelity (В) ДНК-полимераз. Реакции с использованием Q5 Hot Start High-Fidelity ДНК-полимеразы проводились при комнатной температуре. После 30 циклов амплификации продукты анализировались с использованиемLabChip.

До настоящего времени зачастую увеличение точности работы ДНК-полимераз сопровождалось ухудшением эффективности копирования на GC-богатых участках и других сложных ДНК-матрицах. Однако благодаря появлению Q5 полимераз от New England Biolabs появилась возможность использовать ферменты, которые  сочетает в себе высокую точность копирования и универсальность по отношению к содержанию GC.

Система буферов Q5, была оптимизирована для копирования широкого спектра образцов, вне зависимости от величины содержания GC. Для образцов, которые содержат более чем 65% GC, в реакционную смесь добавляется реагент для оптимизации взаимодействия с GC-богатыми и проблемными матрицами (Q5 High GC Enhancer).

Что такое точность ДНК-полимераз и откуда берутся особенные требования к ней?

Точностью полимеразы называют возможность с ее помощью аккуратно копировать предложенный образец. Возможность определяется на первом этапе правильным считыванием информации и на втором этапе – способностью ДНК-полимеразы выбрать подходящий нуклеозидтрифосфат и вставить его на 3'-конец праймера с образованием правильной Уотсон-Криковской пары оснований.

Вероятность вставки неправильного нуклеотида называют «степенью ошибки». Кроме того, некоторые ДНК-полимеразы обладают 3'→5' экзонуклеазной активностью. Эту активность, «проверкой чтения», используется для удаления неправильно вставленных нуклеотидов, которые затем заменяются на правильные. Во время высокоточного ПЦР используется ДНК-полимеразы, которые совмещают в себе низкую «степень ошибки» и способность к проверке, тем самым обеспечивается надежная репликация интересуемого образца (1,2).

Высокоточные High-Fidelity ДНК-полимеразы имеют несколько уровней проверки, для того чтобы защитить от появления ошибки и ее дальнейшего распространения во время копирования ДНК:

1. высокоточные ДНК-полимеразы имеют гораздо более высокое сродство к правильному нуклеотиду во время процесса полимеризации, чем к неправильному;
2. если к активному сайту полимеразы прикрепляется неправильный нуклеотид, из-за конформации образовавшегося комплекса процесс вставки замедляется и за время задержки неправильно присоединившийся нуклеотид диссоциирует, что увеличивает вероятность для прикрепления правильного нуклеотида (3,4);
3. если неправильный нуклеотид был уже вставлен, проверяющая часть полимеразы может «почувствовать» перекручивание, вызванное некомплементарностью пары оснований друг с другом. Далее 3'-конец растущей цепи ДНК перемещается к проверяющему экзонуклеазному домену, читающему в направлении 3'→5'. Тогда благодаря 3'→5' экзонуклеазной активности неправильный нуклеотид удаляется, после чего цепь передвигается обратно к полимеразному домену;

Известно, что задача повышения точности работы ДНК-полимераз имеет многолетнюю историю, например, New England Biolabs начало свои исследования в этой области с открытия Ventr DNA Polymerase, выделенной из Thermococcus litoralis в 1990 г. (зарегистрированная торговая марка New England Biolabs, Inc.). Точность ДНК-полимераз особенно важна следующих случаях:

1. применение амплифицированного in vitro материала далее для клонирования/субклонирования (ПЦР, амплификация всего генома и т.д.);
2. анализ SNP (точечных нуклеотидных полиморфизмов) посредством клонирования и секвенирования;
3. анализ РНК с помощью ПЦР с обратной транскриптазой;
4. другие типы экспериментов, вовлекающие в себя секвенирование образцов, амплифицируемых in vitro.

Конечно же, данные эксперименты могут быть проведены с ипользованием других типов ДНК-полимераз, но в тогда, в случае GC-богатых образцов возможно уменьшение выхода продукта, так же как неспецифичная амплификация. В случае экспериментов NGS (Next generation sequencing) – по секвенированию следующего поколения, ошибки могут привести к исчезновению из результатов эксперимента целых последовательностей.

Литература

1. Mattila, P., et al. (1991) Nucleic Acids Research, 19, 4967–4973. PMID: 1923765
2. Eckert, K. A., & Kunkel, T. A. (1991) Genome Research, 1, 17–24. PMID: 1842916
3. Johnson, K. A. (2010) Biochimica et Biophysica Acta, 1804, 1041–1048. PMID: 20079883
4. Joyce, C. M., & Benkovic, S. J. (2004) Biochemistry, 43, 14317–14324. PMID: 15533035

ДНК-полимеразы можно приобрести как в виде отдельных ферментов: Q5 High-Fidelity и Q5 Hot Start High-Fidelity,

так и в виде наборов: Набор Q5 для HF ПЦР; Набор Q5 для сайт-направленного мутагенеза.

Отдельно можно приобрести также Буфер для Q5 ДНК-полимеразы; Master Mix Q5 HF для ПЦР; Master Mix Q5 Hot Start HF для ПЦР.

Дополнительную информацию о новом поколении высокоточных ДНК-полимераз Q5 от New England Biolabs можно найти на сайте www.Q5PCR.com

Тут можно заказать бесплатный пробный образец ДНК-полимеразы Q5 HF