Реактивы, оборудование и
расходные материалы
для лабораторий
0

#26 Эндонуклеазы рестрикции: молекулярное клонирование и многое другое

27.08.2015

1. Введение

В 1950-е годы, впервые было привлечено внимание к феномену, известному как "контролируемый хозяином/индуцируемый" вариация бактериальных вирусов" в которых бактериофаг был выделен из штамма E.Coli, показал уменьшение в своей способности репродуцировать в различных штаммах, но снова приобрел эту способность в последующих инфекционных циклах. В 1965 г. в статье Вернера Арбера была установлена теоретическая основа для создания систем рестрикции-модификации, функционирующую как бактериальная защита против вторгающихся бактериофагов (3). Первые открытые ЭР опознавали специфические последовательности ДНК, но разрезали на различных дистанциях от сайта узнавания (тип I), следовательно, такие ферменты не могли иметь широкого применения для манипуляций с ДНК.

После этого, открытие и очистка ЭР, которые узнавали и разрезали специфические последовательности (тип II), позволили исследователям проводить точные манипуляции с ДНК in vitro, такие как клонирование экзогенных генов и создание эффективных векторов клонирования.

Сегодня известны более чем 4000 ЭР, они могут узнавать более чем 300 различных последовательностей (полный лист существующих ЭР можно найти на сайте www.rebase.neb.com). C появлением ПЦР, реал-тайм ПЦР, и методик мутагенеза, основанных на ПЦР, традиционное клонирование трансформировало биологические исследования в последующие десятилетия.

2. Улучшение производительности с помощью методов генетической инженерии:

Традиционно, ЭР были очищаемы из оригинального организмы. Создание различных векторов для клонирования, а также выбор новых методик позволил клонировать ЭР. Клонирование не только позволило получать большие количества высокочистых ферментов, но и также сделало возможным инженерю ЭР. Сегодня, более чем 250 ЭР, которые поставляются New England Biolabs - это рекомбинантные протеины.

Способность к разрезанию не специфической последовательности (звездчатая активность), наблюдалась и была задокументирована документирована у ЭР. Некоторые ферменты показывали такую активность при неоптимальных условиях постановки реакции, в то время как другие имеют чрезвычайно узкий диапазон количества единиц активности, которые полностью разрезают исследуемый образец ДНК без проявления звездчатой активности (4). После длительных исследований, ученые New England Biolabs начали создавать ЭР, которые демонстрируют минимальную (если демонстрируют такую), с увеличенным временем реакции, и с высокими концентрациями. Эти исследования позволили ввести в обиход названия высокоточных ЭР (HF RE). Такие ферменты показывают хорошие результаты в чрезвычайно широком диапазоне условий реакций (для дополнительной информации можно посетить сайт www.neb.com/HF).

3. Создание новой специфичности к сиквенсу

Попытки изменять специфичность к последовательности ЭР типа IIP, не привели к успеху., в основном, потому что специфичность к последовательности определяется структурой активных сайтов рестриктаз типа IIP. MmeI - рестриктаза типа IIG, с обоими типами активности - метилтрансферазной и с рестриктазной активностями в одном и том же полипептиде - узнает таргетную последовательность TCCRAC с использованием таргетный узнающий домен (TRD) внутри части отвечающей за метилтрансферазную активность. Это предоставляет отличную возможность для создания вариации в специфичности к сиквенсу в ЭР. В качестве дополнительного преимущества разделение региона узнавания между рестриктазной и метилтрансферазной активностями, происходит эквивалентное изменение метилтрансферазной активности в результате изменения рестриктазной активности, защищая новый таргентный участок от разрезания в рекомбинантных клетках хозяина. при помощи биоинформатического анализа данных гомологичных последовательностей протеинов, ученые NEB идентифицировали аминокислотные остатки, которые узнают специфический основания внутри таргетной последовательности и созданные MmeI мутанты с измененной специфичностью к последовательности.

4. Инженерия никирующих эндонуклеаз

Базовое исследование, вовлекающее в себя ЭР привело к интересным открытиям о кажущемся прямом механизме разрезания. Прототипичные ЭР типа IIP обычно работают как гомодимеры, с каждым из мономеров надрезающим половину палиндромного участка. Тип ЭР IIR , с другой стороны, показывает широкий спектр механизмов разрезания двух цепей, например, гетеродимеризацию в случае BtsI и BbvCI, и сиквенсовое разрезание двухцепочечной ДНК как мономера - в случае FokI. Эти свойства были использованы для создания цепь-специфичных никирующих ферментов (НЭ) (6).

5. Картирование ДНК

Вооруженный только ЭР, в начале 1970-х годов, Даниэль Натанс картировал функциональные части SV40 DNA (8), и открыл эру “рестрикционного картирования” и сравнение сложных геномов. Далее эта методика развилась в более утонченные подходы - которые позволили детектировать нуклеотидные полиморфизмы (SNP), а также вставки и делеции (9), позволяя улучшить применение включая идентификацию локусов заболеваний, оценку генетического разнообразия и тесты для сравнения с родителями.

6.Анализ комбинаций эпигенетических модификаций

Чувствительность ЭР к статусу метилирования таргетных оснований была использована для картирования модифицированных оснований в составе генома. Сканирование генома при помощи метода RLGS (Restriction Landmark Genome Scanning) - это картирование при помощи электрофореза геля 2-х направлениях, с использованием NotI (GC^GGCCGC), AscI (GG^CGCGCC), EagI (C^GGCCG) или BssHII (G^CGCGC) для получения информации о характере метилирования генома во время развития нормальных и раковых клеток. Другая методика - (MSAPMethylation-Sensitive Amplification Polymorphism) использует преимущества различной чувствительности эндонуклеаз рестрикции MspI и HpaII по отношению к статусу метилирования второй С в составе квадруплета CCGG, для идентификации 5-метилцитозина (5-mC) или 5-гидроксиметилцитозина (5-hmC) (10,11). Ученые в лаборатории New England Biolabs далее использовали свойства MspI и HpaII на примере 5-глюкозил гидроксиметилцитозина (5-ghmC) в наборе EpiMark® для анализа 5-hmC и 5-mC (NEB #E3317S)(12), который позволяет отличить 5-hmC от 5-mC для более тонкой идентификации и оценки эпигенетических маркеров (больше информации можно найти на сайте EpiMark.com). Дополнительно, последние исследования нашли ЭР, которые опознают и разрезают ДНК в местах 5-mC и 5-hmC (в том числе MspJI, FspEI и LpnPI), также как те, которые преимущественно разрезают 5-hmC или 5-ghmC через 5-mC или C (в том числе PvuRts1I, AbaSI) (13), и являются потенциальными инструментами для высокопроизводительного картирования основанных на цитозине эпигенетических маркерах в геноме, метилированном по цитозину (14,15).

Для нахождения модифицированных оснований внутри генома, широко используется чувствительность некторых ЭР к статусу метилирования оснований. RLGS (сканирование генома при помощи ориентиров эндонуклеаз рестрикции.

7. Методики сборки ДНК in vitro

Синтетическая биология - это быстро растущий сегмент биологии, в котором определенные компоненты используются для биологических систем для изучения биологических процессов и создание необходимых биологического оборудования (16).

8. Сборка фрагментов "BioBrick"

Общество BioBrick ставит своей задачей возможности создания тысяч "стандартных частей" ДНК для быстрой сборки генов. С помощью ежегодного международного соревнования по генетической инженерии iGEM (Genetically Engineered Machines, www.igem.org), это общество выросло и вызывало интерес множества студентов, которые специализируются в синтетической биологии. Основанный на традиционной методики разрезания и лигирования, BioBricks и методики, которые происходят из этой методики (17), просты в использовании, но они вводят дополнительные сиквенсы в места соединения. также они требуют большое число циклов клонирования для создания работающей биологической системы. В этом состоит главное отличие новых альтернативных методов "бесшовного" клонирования.

9. Создание библиотек ДНК

SAGE (Серийный анализ экспрессии генов) - позволило идентификацию и количественное определение большого числа транскриптов мРНК. Во время изучения раковых заболеваний было широко распространена идентификация мутаций для изучения экспрессии генов. ЭР были ключевыми реагентами для реализации этого протокола. NlaIII - это используется как заякоривающий фермент, благодаря своей уникальной способности узнавать 4-х нуклеотидную последовательность CATG, и создавать четырехнуклеотидный липкий конец эой же последовательности. Использование фермента типа IIS в качестве реагента для мечения, который разрезает все дальше и дальше от последовательности узнаваемой. Позволяет получить болье информации о составе последовательности анализа SAGE (например FokI и BsmFIв SAGE, mmeI в LongSAGE и EcoP15I в SuperSAGE и DeepSAGE.

Методы захватывания хромосомной конформации и производных позволяют картировать пространственную организацию генома с очень высоким разрешением и производительностью (32). ЭР играют незаменимую роль в создании комплементарных концов ДНК, пришитых к взаимодействующим с ними белками, так что пространственно ассоциированные последовательности могут быть лигированы, и следовательно, идентифицированы при помощи высокопроизводительного секвенирования.

Хотя ЭР не позволяют случайную фрагментацию ДНК - что требуют основаные методики секвенирования NGS, они используются в новейших методиках по обогащению (лигирование шпилечных адаптеров (33) и обогащение HaloPlex (Agilent)). Эндонуклеаза AcuI и USER (New England Biolabs), используются для вставки меток в образцы ДНК, которые далее амплифицируются по типу катящегося кольца (RCA), для формирования длинных одноцепочечных "наношары" которые затем служат матрицей для высокоплотного, основанной на чипах технологии секвенирования через лигирование, которая была разработана Complete Genomics (34). ApeKI также использовался для создания библиотек ДНК для генотипирования при помощи секвенирования методики, для изучения сиквенс-разнообразия маиса (35).

10. Создание разрывов в цепи ДНК

До того, как стали доступны никазы (НЭ) негидролизуемые фосфоротиоатные группы были внедрены в специфические цепи таргетной ДНК, такие, что ЭР могут ввести сиквенс и цепь-специфические разрывы в ДНК для применения в таких задачах, как амплификация со смещением цепи (SDA), где смещающая цепи ДНК-полимераза (например ДНК-полимераза Bst 2.0), тянет с новосинтезированного 3'-гидроксильного конца, и реплицирует комплементарную последовательность (36). Из-за регенерируемого никирующего сайта, повторяющаяся никирующий/тянущийся цикл результируется в амплификации специфического одноцепочечного сегмента образца ДНК без необходимости термоциклирования. НЭ позволяют упростить процесс реализации таких методик и открывают возможности для методик, которые не могут быть реализованы при помощи эндонуклеаз рестрикции. Изотермическая амплификация, которая основана на разрезающих ферментах, таких как RCA, NESA, EXPAR и похожих схемах амплификации, показали возможность детектировать малые количества ДНК (37,38). Амплификация ДНК, основанная на никирующих ферментах, стала составной частью в методику молекулярных маяков для амплификации сигнала (39). Введение таких примеров и/или схем амплификации сигнала может привести к простому, но специфическому и чувствительной методики детекции обнаружения таргетной ДНК в поле (NEAR, EnviroLogix). При помощи лигирования адаптеров, содержащих никирующие сайты к концам ДНК с тупыми концами, совместные усилия НЭ и полимеразы, которая расплетает цепи. могут быстро амплифицировать специфические фрагменты двухцепочечной ДНК (40). Амплификация при помощи циклов разрезания/удлинения, податлива к мультиплексированию и потенциально может быть более точной, чем ПЦР. Совместная активность никирующих эндонуклеаз и Bst ДНК-полимеразы были использованы для введения сайт-специфических флуоресцентных меток в длинные/хромосомальные ДНК in vitro для визуализации (нанокодирование) (41). Инновационные методики применения никирующих ферментов включают в себя образование репортерных плазмид с модифицированными основаниями в своей структуре (42), и создание ДНК-моторов, которые транспортируют ДНК без дополнительной энергии (43). Обзор НЭ и способов их применения были опубликованы (6).

11. Редактирование генома in vivo

Способность "вырезать" и "вставить" ДНК при помощи ЭР in vitro конечно же привело к квесту по созданию таких методик in vivo, для коррекции мутаций, которые вызывают генетические заболевания. Прямое использование ЭР и возвращающих в исходное положение рестриктаз в REMI (Restriction Enzyme Mediated Integration) (44,45) позволяет создание трансгенных эмбрионов высших организмов. Однако в такой методике нет возможности контролировать сайт встраивания. Концепция реадктирования генов при помощи сайт-специфичного разрезания была реализована при помощи ZFNs (цинк-специфичных нуклеаз) и TALENs (эффекторных нуклеаз, активирующихся транскрипцией), благодаря их возможности создания двойные разрезы в сложных геномах в выбранном месте. С большим успехом в коррекции генома в модельных организмах (46-50), терапевтический потенциал этих реагенов для редактирования генома был помещен в первые тестирования в фазе I/II клинических исследований в таком режиме, что использование ZFNs для улучшения CD4+ количества T-клеток. Для этого проводился нокаут экспрессии гена CCR5 в антологичных Т-клетках от пациентов с ВИЧ (51). Последние исследования в области CRISP, адаптивной защитной системы бактерий и архей, показали потенциал Cas9-crRNA комплекса как программируемой РНК-направляемой ДНК эндонуклеазы и цепь-специфичных никирующих эндонуклеаз для in vivo редактирования генома (52,53).

12. Перспективы использования эндонуклеаз рестрикции

Эндонуклеазы рестрикции были одни из самых главных движущих сил, которые позволили проводить клонирование генов и трансформирование молекулярной биологии. Новые технологии, такие как клонирование Golden Gate и по Гибсону, продолжают расширять наши возможности по созданию новых молекул ДНК. Потенциал для создания новых последовательностей узнавания в семействе ЭР MmeI, создание новых никаз (NE) и исследование большего количества специфичных к модификациям ЭР будут продолжать оставаться новых инструментов для манипуляции с ДНК и эпигеномного анализа. Инновационные применение этих ферментов позволит развиваться методам молекулярной биологии.

Ссылки на литературу можно найти в документе, который можно скачать как приложение к данному обзору.

Мы надеемся, что наш обзор поможет вам глубже взглянуть на методики с применением эндонуклеаз рестрикции.

Обратная связь

© 2012-2019 SkyGen
Информация и цены на сайте не являются публичной офертой
На нашем веб-сайте мы используем файлы cookie, которые помогают нам создать максимально удобные для посетителя условия пользования сайтом. Если Вы продолжите использовать сайт, мы будем считать что Вас это устраивает.
ОK