#25 Сайт-направленный мутагенез с использованием ДНК-полимеразы Q5

Сайт-направленный мутагенез с использованием ДНК-полимеразы Q5 от New England Biolabs

Сайт-направленный мутагенез - это метод для создания специфических, направленных на определенных участок, изменений в двухцепочечной плазмидной ДНК. Существует множество причин для введения специфических альтераций (вставок, удалений и замен), например:

Изучение изменений в активности протеинов, которая происходит в результате манипуляций с ДНК

Выбрать или сделать скрининг мутаций (на уровне ДНК, РНК или протеинов) с желаемыми свойствами

Ввести или удалить сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции или метки

Набор Q5® для сайт-направленного мутагенеза позволяет провести, сайт-специфический мутагенез двухцепочечной плазмидной ДНК за 2 часа. Основные этапы процесса представлены на рис.3. Набор использует возможности ДНК-полимеразы Q5 Hot Start совместно с специально подготовленными праймерами - для создания вставок, удаления нуклеотидов или замен в широком спектре различных плазмид. После ПЦР, амплифицированный материал добавляется напрямую к уникальной смеси ферментов Kinase-Ligase-DpnI (KLD) - которая имеет в своем составе киназу, лигазу и рестриктазу Dpnl на 5 минут при комнатной температуре, одновременно происходит также удаление матрицы ДНК. Далее проводится трансформация в высокоэффективные компетентные клетки (например NEB 5-alpha Competent E. coli), которые могут поставляться в составе набора (или в другие клетки имеющиеся в лаборатории), позволяет получить надежные и достоверные результаты для плазмид величиной до 20 000 пар оснований в длину.

Набор может использоваться для решения следующих задач:

Введение единичных мутаций

Введение множественных мутации, длиной до 100 п.о.

Удаление нуклеотидов

Удаление интронов, протеиновых меток, усечение последовательности

Вставка сайтов разрезания протеаз

Вставка меток для протеинов (HIS, HA, Flag…)

Рис.3. Принципиальная схема проведения сайт-направленного мутагенеза с использованием Q5 набора для сайт-направленного мутагенеза от New England Biolabs.

Мы надеемся, что наш обзор позволит вам внедрить новый подход в вашей работе! С вашими вопросами и пожеланиями, обращайтесь, пожалуйста по электронному адресу info@skygen.com