#23 BrilliantDye™ Terminator - новая альтернатива для секвенирования по Сэнгеру на платформе ABI с химией v1.1!

21.07.2015

Введение

Мы спешим порадовать всех, кто занимается секвенированием на платформе Applied Biosystems, и использует для реакции терминирующего секвенирования по Сэнгеру наборы BrightDye™, Bigdye™ v3.1 или Bigdye™ v1.1. Новый продукт на рынке - BrilliantDye™ Terminator Sequencing Kit, является альтернативой для всех трех наборов и сочетает в себе возможности секвенирования как коротких, так и длинных фрагментов.

В прошлом году лаборатории в России получили доступ к альтернативным реагентам BrightDye™ Terminator от Нимаген, этот набор позволяет заменить Bigdye™ v3.1. Однако исследователи, использующие Bigdye™ v1.1 не могли воспользоваться этим набором. Анонсируемый сегодня набор BrilliantDye™ Terminator позволяет нашим клиентам получить набор, который может быть использован как для экспериментов с подвижностью аналогичной Bigdye™ v3.1, так и v1.1.

1. Набор для реакции терминирующего секвенирования BrilliantDye™ Terminator

Набор для секвенирования BrilliantDye™ Terminator обеспечит проведения этапа реакции с терминирующими дидезоксинуклеотидоами для секвенирования по Сэнгеру на платформах ABI 310, 3100 (AVANT), 3130 (XL), 3500 (XL), 3730 (XL). Набор поставляется в виде готовой к использованию смеси для секвенирования с концентрацией 2,5Х, состав которой полностью оптимизирован для всего широкого спектра приложений.

Основные преимущества использования BrilliantDye™ Terminator:

Проведение секвенирования de novo и ресеквенирования. Состав смеси оптимизирован для получения пиков сбалансированной высоты для получения длинных качественных сиквенсов длинных фрагментов.

Использование для определения сиквенсов коротких ПЦР-продуктов при следующих модулях работы прибора: быстрый, скорый или ультра-быстрый, а также в режиме работы высокого качества прочтения оснований (High Quality Base Calling) для малых фрагментов.

Секвенирование ПЦР-продуктов (длинных) с максимальной длиной прочтения для модуля для стандартных и длинных отрезков.

Секвенирование плазмидной ДНК с максимальной длиной прочтения

Чувствительность к детекции гетерозигот с оптимизированным распределением высот пиков

Набор оптимизирован для работы с набором фильтров Е (Dye set У для Bigdye™ Terminator v1.1). С использованием инструкции к вашему прибору, вы с успехом откалибруете систему с данным набором красок. В то же время может быть использован набор Dyeset Z, но его использование менее оптимально.

В таб.1 представлен состав наборов BrilliantDye™ Terminator.

Все наборы BriliiantDye™ содержат контрольный образец ДНК (pGEM плазмидная ДНК) и контрольный праймер (-21M13). Использование 1 мкл образца и 1 мкл праймера для реакции секвенирования подтверждает оптимальное проведение всей последовательности экспериментов для проведения секвенирования. Показывает, что все сделано правильно, и нет ошибок в соответствии праймеров и матрицы. Последовательность праймера и матрицы для секвенирования приводится полностью в сопровождающих документах.

Название	Кол-во	Готовая смесь для секвенирования	5ХБуфер для секвенирования	pGEM контроль	m13 (-21) праймер
BRD1-010	10	1х80uL	1x0.25mL
BRD1-024	24	1x192uL	1x0.65mL	1x10uL	1x10uL
BRD1-100	100	1x800uL	1x2.0mL	1x10uL	1x10uL
BRD1-1000	1000	10x800uL	8x2.0mL	1x50uL	1x50uL
BRD1-5000	5000	50x800uL	40x2.0mL	5x50uL	5x50uL

Таблица 1: состав наборов BrilliantDye™ от Nimagen.

2. v1.1, v3.1 - о чем идет речь? Чем отличаются друг от друга два разных подхода на различной подвижности химии?

Для различных задач могут использоваться различные подходы, которые реализуются на рынке при помощи наборов Bigdye™ v1.1 и Bigdye™ v3.1, альтернативой которым являются предлагаемые компанией СкайДжин более доступные BrightDye™(v3.1) и BrilliantDye™ (химия v1.1 и v3.1) от компании Nimagen.

В таблице 1 представлены основные области применения v3.1 и v1.1. В целом, область применения v3.1 значительно выше, но для задач по секвенированию коротких ПЦР продуктов с использованием быстрого модуля работы приборов ABI. В таком случае прочтение начинается прямо от праймера, и не теряется порядка 20 нуклеотидов, как это может произойти в случае v3.1. Также можно отметить, что длина прочтения в случае v1.1 значительно меньше.

Задачи	Химия v3.1 (BrightDye™)	Химия v1.1	Химия v1.1 & v3.1 (BrilliantDye™)
Секвенировние de novo	Оптимально	Удовлетворительно	Оптимально
Ресеквенирование	Оптимально	Удовлетворительно	Оптимально
Секвенирование сложных объектов	Удовлетворительно	Удовлетворительно	Удовлетворительно
Длинные фрагменты прочтения (>650 нукл.)	Оптимально	Удовлетворительно	Оптимально
Секвенирование различных объектов (плазмиды, BACs, фосмиды)	Оптимально	Удовлетворительно	Оптимально
Детекция смешанных оснований	Оптимально	Удовлетворительно	Оптимально
Секвенирование коротких ПЦР-продуктов, быстрый модуль электрофореза	Не оптимально	Оптимально	Оптимально
Высокая точность прочтения вблизи праймера	Не оптимально	Оптимально	Оптимально
Универсальный праймер-адаптер, отличный от праймера М13	Удовлетворительно	Удовлетворительно	Удовлетворительно

Таблица 2. Сравнительный обзор возможностей применения для секвенирования различных вариантов химии с разной подвижностью.

3. Какой набор от Nimagen лучше подойдет для Ваших целей: BrilliantDye™ Terminator или BrightDye™ Terminator?

Чем отличается новый набор BrilliantDye™ от BrightDye™ от Nimagen?

Принцип работы BrilliantDye ™ Terminator основан на химии с подвижностью, аналогичной BigDye™ v1.1 и v3.1, в то время как BrightDye™ - на химии с подвижностью, аналогичной BigDye™ v3.1. Поэтому, мы рекомендуем пользователям химии v3.1 использовать BrightDye™, а пользователям химии v1.1 - BrilliantDye™.

Однако, если в вашей лаборатории используются оба типа подвижности - следует обратить внимание на BrilliantDye™.

4. Набор BrilliantDye Terminator обеспечивает прочтение с 1 до 990 нуклеотида последовательности, совмещая преимущества химии v1.1 и v3.1

На рис.1 представлены результаты секвенирования на платформе ABI 3130, где достоверное распознавание нуклеотидов начинается с 10 основания и заканчивается 980. Таким образом, набор сочетает в себе преимущества обоих подходов к секвенированию по Сэнгеру - как химии v1.1, так и химии v3.1. Как известно, при использовании химии v3.1 проводится секвенирование длинных фрагментов, до 950 нуклеотидов, но достоверное распознавание начинается примерно с 20 нуклеотида с начала сиквенса. При использовании химии v1.1 наоборот, прочтение начинается с первого нуклеотида последовательности, но для секвенирования подходят лишь короткие фрагменты.

brilliantdye_protocol_v1 0.png brilliantdye_protocol_v1 0-2.png