Реактивы, оборудование и
расходные материалы
для лабораторий
0

#17 Решения для лабораторий, работающих с поврежденными образцами ДНК

17.04.2015

Что делать, если ДНК и РНК приходится выделять из образцов, которые хранились в формалине (FFPE образцы) или просто в холодильнике в течение долгого времени? Или это музейные образцы, или во время транспортировки не удалось выдержать температурный режим?

Во всех этих случаях ДНК (и особенно РНК) разрушаются. А если после выделения нуклеиновых кислот их планируется секвенировать, амплифицировать или использовать для реал-тайм ПЦР?

В этом обзоре мы расскажем о наших продуктах, специально предназначенных для улучшения качества нуклеиновых кислот.

Классификация типов повреждений, вносимых в ДНК

ДНК подвергается разрушению под влиянием химических факторов, окружающей среды, манипуляций с ДНК, и вследствие хранения. В таблице 1 мы приводим список основных типов образцов ДНК, а также основные факторы, приводящие к повреждению ДНК, с перечислением типов повреждения.

Таблица 1. Список возможных типов образцов ДНК, и виды воздействий, которые могут вызывать разрушение ДНК.

Источник ДНК Потенциальное повреждение Комментарий
Древняя ДНК Потеря оснований, деаминирование цитозина, окисленные основания, фрагментация, выщепление оснований Деаминирование цитозина было показано, является основной причиной артефактов секвенирования древней ДНК
ДНК из окружающей среды (плазмидная и геномная) Фрагментированность, выщепление оснований Степень фрагментации и выщепления оснований увеличивает образование искусственных химерных генов во время амплификации

Источник повреждения

Контакт с ионизирующей радиацией Потеря оснований, деаминирование цитозина, фрагментация и выщепление оснований Ионизирующая радиация, например, воздействует во время сетирилизации образцов
Нагревание Фрагементация, выпадение оснований, выщепление оснований, окисление оснований, деаминирование цитозинов, повреждение пуриновых оснований,
Нагревание ДНК ускоряет реакции окисленияи гидролиза в водных растворах
Экстракция фенолом/хлороформом Окисленные основания Гуанидин является более чувствителен к окислению чем другие основания, и образует 8-оксо-G, который обазует пару с А, что является потенциальным иточником мутагенеза
Контакт с ультрафиолетовым излучением
Димеры тимидинов (циклобутановые димеры тимидинов), продукты фотосшивки пиримидинов (6-4) Ультрафиолет, используемый для визуализации ДНК, может вызывать формирование димеров тимидинов
Механические повреждения Фрагментация, выщепление оснований Механические повреждения вызывают обычные манипуляции, такие как пипетирование и перемешивание
Высушивание Фрагментация, выщепление оснований, окисление оснований
-
Хранение в водном растворе Выпадение оснований, окисление оснований, деаминирование цитозинов, выщепление оснований, фрагментация Долговременное хранение водных растворов вызывает увеличение количества повреждений
Контакт с формалином Кросс-сшивки ДНК-ДНК, ДНК-протеин Раствор формальдегида, который не был правильно сбалансирован, закисляется, что усиливает формирование участков с утерянными основаниями

Сегодня, мы расскажем про набор для выделения ДНК и РНК из тканей, зафиксированных формалином в парафине (Bioline, Великобритания), набор для восстановления ДНК PR PCR (New England Biolabs). Лабораториям, проводящим секвенирование следующего поколения NGS - мы можем порекомендовать специальный набор для восстановления ДНК из зафиксированных тканей NEBNext, а также Т4-полинуклеотидкиназу (New England Biolabs) - для восстановления разрушенной РНК.

1.Набор для выделения РНК/ДНК из тканей зафиксированных формалином в парафине ISOLATE II

Начать наш рассказ мы хотим с нашей новинки - набора для колоночного выделения, специально предназначенного для получения ДНК и РНК из тканей, зафиксированных формалином в парафине.

Преимущества использования набора ISOLATE II

  • ДНК/РНК из единого образца ткани в парафине (FFPE образца) без необходимости разделять лизат, что увеличивает достоверность эксперимента
  • выделяется РНК всех размеров, как большие фрагменты мРНК, так и микроРНК. Также выделяется ДНК, по размеру большая, чем 80 п.о.
  • частичное избавление от сшивок между нуклеиновыми кислотами и протеинами, вызванных формальдегидом
  • оптимизированный протокол для получения нуклеиновых кислот с высокой чистотой и выходом
  • отсутствие этапа экстракции органическими растворителями (в т.ч. отсутствие фенола)
  • отсутствие повреждений РНК, внесенной органическими растворителями
  • ДНКаза I включена в набор
  • полное избавление фракции РНК от геномной ДНК
  • Выделенная РНК может использоваться в следующих экспериментах:

  • реал-тайм ПЦРБ
  • секвенирование
  • анализ экспресии

    Выделенная ДНК может использоваться в следующих экспериментах:

  • реал-тайм ПЦР
  • мультиплексная ПЦР
  • анализ метилирования (с использованием бисульфитной конвертации и секвенированием)
  • NGS секвенирование
  • определение SNP с использованием микрочипов
  • Набор для выделения ДНК и РНК из зафиксированных формалином в парафине образцов (FFPE образцов), был разработан специально для избавления от сшивок между нуклеиновыми кислотами и протеинами, которые образуются во время контакта ткани с формальдегидом. К тому же во время хранения в парафине, происходит частичная деградация нуклеиновых кислот, что уменьшает их молекулярный вес.

    Другой задачей, для решения которой был создан набор - является возможность выделения ДНК и РНК без разделения одного образца на две части. Такое преимущество будет важно для интегративного исследования генома, эпигенома и транскриптома. Разделение нуклеиновых кислот друг от друга основано на использовании нового аффинного разделительного матрикса.

    2.Набор PreCR® для репарации ДНК

    Наиболее универсальным решением для восстановления поврежденной ДНК, из представленных нами, является набор для восстановления поврежденной ДНК PreCR от компании New England Biolabs.

    Список повреждений ДНК, которые могут быть восстановлены с использованием набора PreCR:

  • Вызванное гидролизом отщепление нуклеотида
  • Разрывы цепи
  • Димеры тимидинов, вызванные ультрафиолетовым облучением
  • Блокированные 3'-концы
  • Окисление гуанина
  • Окисление пиримидиновых оснований
  • Деаминирование цитозина
  • Набор для восстановления ДНК PreCR® - это смесь ферментов, в соотношении, которое обеспечивает максимально эффективное восстановление поврежденного образца ДНК, перед тем, использованием его в ПЦР, реакциях с микрочипами и в других приложениях. Набор позволяет устранить широкий спектр повреждений ДНК, включая те, которые могут блокировать ПЦР (апуриновые и апиримидиновые участки, димеры тимидинов, выщепленные основания и пропуски последовательности). Также позволяет работать с повреждениями, которые являются мутагенными (например деаминирование цитозина и 8-оксо-гуанин). Также компоненты набора удаляют функциональные закрывающие группы с 3'-конца, оставляя свободную гидроксильную группу. Это уменьшает возможность образования химерных генов как продуктов лигирования. После использования набора возможно применять любую термофильную полимеразу.

    Процесс восстановления, например части ДНК, лишенной основания возможно описать следующей схемой - ДНК-репарирующий фермент находит часть, лишенную основания, и разрезает скелет ДНК. Полимераза достраивает цепь, и лигаза снова сшивает разрезанные участки.

    3.Смесь ферментов NEBNext для восстановления ДНК, выделенной из фиксированных тканей

    Специально для лабораторий, которые получают образцы для секвенирования следующего поколения NGS в виде тканей, зафиксированных в формалине, мы рады предложить новинку линейки NEBNext - набор для восстановления ДНК, выделенной из зафиксированных тканей.

    Рисунок 1. Результаты анализа библиотеки NGS, с использованием набора для восстановления ДНК, выделенной из фиксированных в формалине тканей и без.

    FFPE1.png

    Во время фиксации образцов тканей формалином парафине вызывает разрушение нуклеиновых кислот. В результате, трудно получить требуемую информацию, особенно при секвенировании NGS. Коктейль восстанавливающих ферментов был специально оптимизирован для восстановления такие FFPE образцов. В таблице показано, какие типы повреждений исправляют при помощи набора.

    Таблица 2. Типы повреждений ДНК, и их возможность устранить с использованием набора NEBNext для восстановления ДНК, выделенной из фиксированных тканей.

    Тип повреждения ДНК  Можно ли исправить при помощи набора NEBNext для восстановления ДНК, выделенной из фиксированных тканей
    Деаминирование цитозина в урацил Да
    Выщепленные основания Да
    Окисленные основания Да
    Блокированные 3'-концы Да
    Фрагментация ДНК Нет
    Сшивки между ДНК и протеинами Нет

    При сравнении выхода библиотеки в количестве - в случае образцов печени (нормальная ткань), зафиксированной формалином в парафине, и после хранения в течение 11 лет, при использовании набора выход увеличивался в 3 раза. Для злокачественных образцов желудка и поджелудочной железы, хранившихся в течение 2 и 4 лет - выход увеличивается в 2 раза.

    4.РНК Т4-полинуклеотид киназа

    Для приготовления РНК-библиотек из образцов FFPE с помощью NEBNext рекомендуется предварительно обработать полученную РНК Т4-полинуклеотидкиназой для «исправления» неправильного фосфорилирования 3’- и 5’-концов после фиксации образца.

    Заключение

    Мы надеемся, что представленные продукты позволят улучшить качество вашей ДНК и успешно провести реакции!

    Обратная связь

    © 2012-2019 SkyGen
    Информация и цены на сайте не являются публичной офертой
    На нашем веб-сайте мы используем файлы cookie, которые помогают нам создать максимально удобные для посетителя условия пользования сайтом. Если Вы продолжите использовать сайт, мы будем считать что Вас это устраивает.
    ОK