Реактивы и оборудование
для лабораторий
0

#15 Амплификация полного генома отдельной клетки - решение от New England Biolabs

17.03.2015

Часто ли вы оказывались в такой ситуации, когда исчезающе малые количества исходного материала не позволяют думать продолжении экспериментов? Существуют также ситуации, когда важно получить ДНК одной единственной клетки. Сегодня все это стало возможно, благодаря появлению новых, сверхпродуктивных ДНК-полимераз, и мы расскажем, как генетический материал отдельной клетки можно подвергнуть секвенированию.

Метод полной амплификации генома клетки особенно актуален для изучения эмбрионального развития, дифференциации стволовых клеток, нейронов и разработки новых подходов для лечения опухолевых заболеваний.

В каком направлении должны были двигаться исследователи, чтобы иметь возможность увеличить то мизерное количество ДНК и РНК, которое можно получить из одной единственной клетки в миллионы раз и получить количество, достаточное для анализа?

Набор для полной амплификации генома клетки PicoPLEX™ WGA Kit эффективно амплифицирует общую ДНК из одной клетки или ДНК эквивалента одной клетки в 1 миллион раз, получением 2-5 мг амплифицированной ДНК меньше чем за 3 часа.

Для решения каких задач возможно использовать набор для полной амлпификации генома клетки?

  1. Анализ вариаций числа копий (Copy Number Variation, CNV)
  2. SNP генотипирование
  3. Детекция мутаций
  4. Секвенирование

Принцип метода полной амлпификации генома клетки (WGA)

Набор для полной амплификации генома клетки PicoPLEX™ WGA Kit позволяет эффективно амплифицировать целиком ДНК, содержащуюся в одной клетке, до суммарного количества в 2-5 мкг за 3 часа (в результате протокола происходит увеличение количества исходной ДНК в 1 миллион раз). Длина получаемых при помощи набора ампликонов варьирует от 200 до 1000 п.н.

picoplex_picture.png

Рис.1. Последовательность действий при проведении 3-х шагового протокола амплификации генома одиночной клетки или 15 пг - 15 нг ДНК.

Какие преимущества дает использованием методики полногономной амплификации клетки (WGA)?

  1. Возможность амплификации генома отдельно взятой клетки. Эффективность амплификации единичного бластомера и полярных телец достигает 95%.
  2. Набор может быть также применен при необходимости амплификации неопределенного малого количества исходного материала (от одной до тысячи клеток или от нескольких пикограмм до нескольких нанограмм ДНК).
  3. Метод позволяет одинаково успешно амлифицировать как AT-, так и GC-богатые регионы.
  4. Высокая воспроизводимость: коэффициент корреляции между значениями Ct при повторных ПЦР в реальном времени достигает 90%.
  5. Специфичность и высокая эффективность метода могут быть наглядно проиллюстрированы (Рис.2.) путем сравнения роста кривых амплификации одиночного клеточного генома и отрицательного контроля: нарастание сигнала в пробирках с отрицательным контролем происходит с отставанием, как минимум, в 5 ПЦР-циклов.

E2620_2.jpg

Рис.2. Амплификационные кривые, полученные при проведении ПЦР при помощи набора для полной амплификации генома клетки в режиме реального времени на приборе Bio-Rad I Cycler iQ.

Другим примером эффективности работы может служить электрофореграмма разделения продуктов ПЦР после использования набора WGA (рис.3).

E2620_3.jpg

Рис. 3 Электрофореграмма разделения продуктов ПЦР в 1,4% агарозном геле. Дорожка 1: отрицательный контроль, дорожки 2 и 3: продукты двух независимых реакций с использованием 15 пг геномной ДНК человека, М: Маркер 2-Log 0.1-10 т.п.н. длин ДНК.

Амплификация полного генома отдельной клетки для последующего секвенирования NGS

Во-первых, давайте вместе посчитаем: в одной клетке находится 70-100 пг ДНК и порядка 10 пг тотальной РНК (что составит 0,1-0,5 пг мРНК). Для того, чтобы, например, приготовить ДНК библиотеку для NGS с помощью набора NEBNext для Illumina, нам потребуется 1-5 мкг ДНК (в случае набора NEBNext Ultra - 5 нг-1 мкг). Значит, при условии увеличения количества ДНК в 10 000 раз возможно будет создать библиотеку NGS. Для РНК задача усложняется: для использования набора NEBNext для создания библиотеки потребуется 100 нг-1мкг тотальной РНК (10 нг-1 мкг для набора Ultra). Получаемое количество ДНК после использования набора, даже с учетом потерь на очистку, достаточно для проведения NGS эксперимента.

Cостав набора

  • Фермент для экстракции ДНК
  • Фермент для подготовки к амплификации
  • Фермент для амплификации
  • Буфер для экстракции
  • Буфер для разведения фермента для экстракции
  • Реакционная смесь для подготовки к амплификации
  • Реакционная смесь для амплификации
  • Очищенная от нуклеаз вода
  • Температура хранения: -20°С

    Примечания:

    Пробирки с ферментами следует доставать из холодильника и ставить на планшет со льдом только перед непосредственным их использованием. Остальные компоненты набора можно размораживать на планшете со льдом, а перед использованием их следует перемешать при помощи вортекса.

    Набор для полной амплификации генома клетки предполагает работу со сверхнизкими (пикограммы) количествами ДНК, поэтому при работе с ним необходимо соблюдать особую осторожность для предотвращения возможной контаминации.

    Мы надеемся, что представленная в данном обзоре информация будет полезна, и поможет вашей работе! Со всеми вопросами и предложениями (в том числе по тематикам обзоров, которые интересные) обращайтесь по электронной почте info@skygen.com, и по телефонам: +7 (495) 215 02 22; +7 (800) 333 12 26

    Обратная связь

    © 2012-2019 SkyGen
    Информация и цены на сайте не являются публичной офертой
    Изготовление сайта – НБС-Медиа
    На нашем веб-сайте мы используем файлы cookie, которые помогают нам создать максимально удобные для посетителя условия пользования сайтом. Если Вы продолжите использовать сайт, мы будем считать что Вас это устраивает. ОK