#14 Выделение микроРНК, РНК и ДНК с использованием phenol-free колоночных наборов от Bioline

Мы продолжаем расширять нашу линейку для колоночного выделения нуклеиновых кислот из самых разных образцов. Сегодня мы хотим обратить внимание всех, кто работает с микроРНК, тотальной РНК, а также с образцами тканей в парафине на новинки для колоночного выделения:

Набор для выделения РНК из биологических жидкостей позволяет выделить РНК высокого качества из физиологических жидкостей - крови/сыворотки, мазков изо рта, клеточных культур, вирусов.

Набор для выделения микро РНК и набор для выделения микро РНК из растений позволяют получить тотальную РНК и микроРНК из самых различных образцов (см. Табл.1 в тексте обзора).

Набор для выделения РНК/ДНК из тканей, зафиксированных формалином в парафине позволяет получить геномную ДНК и тотальную РНК хорошего качества из проблемных образцов.

Набор для выделения ДНК/РНК/протеинов позволяет выделить три различных типа макромолекул из одного образца без этапа экстракции органическими растворителями.

Преимущества линейки наборов для выделения РНК от ISOLATE II

Безопасность: простой протокол, без использования токсичных химикатов (без фенола)

Достоверные результаты: возможность очистить как микро РНК, так и малые РНК (длиной до 200 нуклеотидов) без разрушения, вызываемых использованием фенола

Быстрый протокол: без трудоемкого этапа разделения фаз и осаждения спиртом

Надежность: без инициируемого фенолом разрушения образцов

Использование для дальнейших экспериментов: РНК готова к дальнейшему использованию в большинстве экспериментов

Было показано, что малые РНК с малым содержанием GC могут быть селективно потеряны при очистке с использованим фенола (Kim et al., Molecular Cell 46(6): 2012).

Таблица 1. Типы образцов, из которых возможно выделять микро РНК, РНК, ДНК и протеины при помощи наборов для выделения ISOLATE II

Давайте подробнее остановимся на каждом из рассматриваемых наборов.

1. Набор для выделение РНК из биологических жидкостей и из вирусов

Типы выделяемой РНК:

большие фрагменты мРНК

вирусная РНК

рибосомальная РНК (rRNA)

малые РНК, такие как микроРНК (miRNA) и короткие интерферирующие РНК (siRNA)

Откуда выделяется РНК?

кровь/плазма/сыворотка

семенная жидкость

слюна

цереброспинальная жидкость (CSF)

вирусы

Откуда выделяется вирусная РНК?

Кроме перечисленных выше типов образцов, также из культивируемых клеток и тканей.

Принцип выделения:

Колоночное выделение с использованием аффинного полимера, связывающего РНК разного размера (используется новый тип silica, к которой преимущественно присоединяются малые РНК). Набор не использует фенол и хлороформ.

Образцы подвергаются лизису в присутствии гуанидиниум тиоционата, и хаотропных солей, которые деактивируют эндогенные РНКазы и позволяют выделить неповрежденную РНК. Затем, геномная ДНК захватывается колонками и удаляется. Добавляется этанол, и РНК переносится в колонку для выделения РНК. Далее, тотальная РНК задерживается колонкой и может быть избавлена от примесей при промывании.

Полученная высокочистая РНК может быть использована в следующих экспериментах:

реал-тайм ПЦР (qPCR)

реакция обратной транскрипции

синтез кДНК

секвенирование следующего поколения

Nothern blotting

2. Набор для выделения РНК/ДНК из тканей, зафиксированных формалином в парафине

Набор обеспечивает выделение и очистку геномной ДНК и тотальной РНК (включая микроРНК) из образцов тканей в парафине. Зафиксированные в парафине ткани характеризуются образованием связок между нуклеиновыми кислотами и белками, и друг с другом. Фиксация также часто характеризуется фрагментацией ДНК с течением времени. Набор позволяет частично избавиться от модификаций, вызванных формалином, увеличивая качество и выход нуклеиновых кислот.

Разделительный матрикс в составе колонок позволяет отделять РНК и ДНК от других компонентов клеток. Набор не требует использования хлороформа и фенола.

На первом этапе избавляются от парафина при помощи промывки ксиленом и этанолом, далее образцы разлагаются с использованием Протеиназы К и специального буфера. Растворимый лизат собирается для очистки РНК, а оставшийся образец разлагается для выделения ДНК. Лизирующий буфер и этанол добавляются в лизат, содержащий ДНК и РНК и переносят в микроколонки для выделения РНК и ДНК. Связанные нуклеиновые кислоты промываются. Очищенные РНК и ДНК могут использоваться для широкого спектра экспериментов.

3. Набор для выделения микроРНК и набор для выделения микроРНК из растений

Набор был разработан для выделения обогащенной микроРНК (размер составляет <200 нуклеотидов), выделение происходит из следующих образцов:

культивируемые клетки

ткани млекопитающих

бактерии

кровь

другие биологические жидкости

Какие типы малых РНК выделяются:

регуляторные молекулы РНК (такие например как микроРНК (miRNA)

короткие интерферирующие РНК (siRNA),

транспортные РНК (tRNA)

РНК из 5Sсубъединицы (rRNA)

Малые РНК, имеющие длину 20-25 нуклеотидов, вовлечены в регуляцию генной экспрессии при помощи связывания с мессенджер РНК (mRNA)

Принцип выделения

РНК прикрепляется к колонки при помощи аффинного связывания,при этом при помощи размера пор возможно разделить РНК по размеру.

Тотальная РНК, в растворе этанола проходит через связывающую колонку, где большие фрагменты РНК остаются связанными, а малые смываются в супернатант. Далее супернатант, содержащие малые РНК проходит через колонку для выделения малых РНК, где связываются малые молекулы.

4. Набор для выделения ДНК/РНК/протеинов

Набор позволяет выделить и очистить с высоким качеством одновременно следующие три компонента, из одного образца

тотальную РНК (включая малые РНК),

геномную ДНК

белки

Выделение может проводиться из следующих образцов:

культивируемые клетки

ткани млекопитающих

биологические жидкости (включая слюну, мочу, семенную жидкость и кровь)

бактерии

дрожжи,

грибы

растения

Особенно набор подходит для исследователей, которые выделяют макромолекулы из особенно ценных, труднодоступных образцов (таких как результаты биопсии), - потому что это позволяет не проводить фракционирование образца. Также, анализ становится более достоверным, вследствие того, что РНК, ДНК протеины получаются из одного и того же образца.

Протокол предотвращает деградацию РНК (при помощи перемешивания образца с гуанидинумом тиоцианатом. Геномная ДНК захватывается и отделяется при помощи ДНК колонки. Оставшийся супернатант погружается в колонку для выделения РНК/протеинов. Далее тотальная РНК (включая микроРНК) связывается с поверхностью колонки, в то время как протеины остаются в растворе. Протеины, оставшиеся в промывном растворе - могут быть нанесены непосредственно на SDS-PAGE гель, для визуального анализа, или очищаться. Набор не содержит фенол и хлороформ.

Становится возможным исследовать одновременно геном, транскриптом и проводить протеомные исследования в одном образце. Очищенная РНК может быть использована для реал-тайм ПЦР, ПЦР с обратной транскрипцией, Nothern Blotting, экспериментах по секвенированию и экспрессии.Полученная ДНК может быть использована для ПЦР, реал-тайм ПЦР, NGS секвенирования, генотипирования. Белки могут быть использованы для SDS-PAGE, Цуыеукт Идщеештпб 2-D гелей, масс-спектрометрии.

Заключение

Мы надеемся, что новая альтернатива представленным на рынке методам и продуктам для выделения РНК (и микроРНК) позволит упросить и удешевить проведение экспериментов с использованием РНК. По всем возникаюшим вопросам, пожалуйста, обращайтесь по электронной почте info@skygen.com!