Выращивание органов – фантастика или уже реальность?

Выращивание органов - весьма амбициозная идея, которая сейчас становится всё более реальной. А значение таких исследований имеет колоссальную важность в медицине благодаря созданию органов непосредственно из клеток пациента, их пересадке и успешной трансплантации. 

В этом обзоре мы хотим рассказать, на каком этапе сейчас находятся исследователи, какие методы они используют и какие новые идеи предлагают для дальнейшей работы.

Вступление

Межклеточные взаимодействия управляют многочисленными процессами во время эмбрионального развития и гомеостазом тканей взрослого организма, а изменения этих взаимодействий могут привести к возникновению заболеваний. Таким образом, полное понимание клеточных взаимодействий имеет решающее значение для многих физиологических и патологических процессов. Однако для этого требуются соответствующие экспериментальные модели для точного воспроизведения клеточного микроокружения in vivo. 

На сегодняшний день двумерные (2D) культуральные системы в основном используются для исследования клеточных взаимодействий ^[1]. Эти модели основаны на прикреплении клеток к подложке, которая обеспечивает механическую поддержку и доступ к питательным веществам из питательной среды. 2D-модели могут быть полезны для предварительной оценки прямого взаимодействия одного типа клеток с другим, однако их упрощенная структура существенно отличается от очень сложной микросреды в организме, которая состоит из множества типов клеток, химических градиентов, растворимых факторов, механической среды (матрикс и интерстициальный поток) и газов (кислород, углекислый газ) ^[2].

За последнее десятилетие междисциплинарные исследования позволили продвинуться в моделировании клеточных взаимодействий посредством создания синтетических трехмерных (3D) многоклеточных систем ^[3]. Эти 3D-модели лучше воспроизводят биохимическую и биомеханическую микросреду in vivo в сравнении с методами 2D-культивирования. Поэтому сейчас появилось большое разнообразие трехмерных многоклеточных систем, включая органоиды и сфероиды, а в последнее время ассемблоиды и системы "орган или ткань на чипе" (Рис. 1) ^[4].

Рис. 1. Список существующих трехмерных многоклеточных систем.

Подходы к созданию трехмерных многоклеточных систем

Одними из наиболее часто используемых биологических каркасов для трехмерных органоидов являются гидрогели. Гидрогели наиболее часто используются для создания биологических каркасов, обеспечивающих механическую поддержку клеток и создающих искусственную клеточную микросреду ^[5,6]. Кстати, в каталоге SkyGen есть такой продукт – это Gelnest ™ Матрикс от китайского производителя NEST.

Другой способ создания трехмерной клеточной структуры – биопечать ^[7]. Этот способ использует живые клетки в качестве «чернил» и позволяет как бы «печатать» многоклеточные системы по заданному дизайну. Однако в настоящее время возможности биопечати органоидов ограничены, поскольку соблюдение всех необходимых требований к оборудованию, материалам, химическим веществам и биообработке остается непростой задачей. 

Следующий подход «орган на чипе» позволяет имитировать различные сигналы, которые недоступны в других методиках. Ведь помимо локальных межклеточных взаимодействий, клетки in vivo подвергаются механотрансдукции в ответ на внешние раздражители, такие как механическое взаимодействие, поток и давление ^[8]. Эти силы влияют на поведение клеток и должны учитываться при инженерном проектировании зрелых органоидов. Кроме того, некоторые трехмерные органоиды полагаются на пассивную диффузию для получения питательных веществ и удаления отходов, которая становится недостаточной с увеличением размера органа, что снова препятствует формированию органоидов ^[9].

Модели "орган на чипе" обычно изготавливаются из прозрачных гибких полимеров, таких как полидиметилсилоксан (PDMS), содержащих полые микроканалы, в которых выращивают различные типы клеток. Контролируемая среда этих моделей позволяет исследователям изучать сложные межклеточные взаимодействия, исследовать соответствующие сигнальные пути, получать представление о механизмах заболевания и изучать эффекты различных медикаментозных методов лечения ^[10].

Органоиды и модели "орган на чипе" изначально были различными подходами, хотя сейчас ученые начинают изучать возможность их объединения, чтобы использовать преимущества обоих. Например, недавно был разработан кишечный органоид на чипе с пространственным расположением, имитирующим кишечную полость, и просветом для непрерывного удаления продуктов жизнедеятельности. Более того, в этой модели органоида на чипе были идентифицированы редкие специализированные типы клеток кишечника, которые не были обнаружены в обычных контрольных кишечных органоидах ^[11].

Трехмерные многоклеточные системы при моделировании заболеваний

Многоклеточные 3D системы все чаще используются для моделирования взаимодействий между различными типами клеток в желудочно-кишечном тракте человека. ЖКТ млекопитающих действительно представляет собой очень сложную систему органов, состоящую из гетерогенной популяции клеток, например клеток иммунного, нервного и эпителиального типов ^{[12, 13]}. Следовательно, модели, способные включать множество различных типов клеток, могут лучше отражать сложность межклеточных взаимодействий, лежащих в основе развития ЖКТ, гомеостаза взрослого организма и развития различных заболеваний. 

Например, исследователи из США создали органоиды кишечника человека, полученные из стволовых клеток, которые содержат функциональные энтероциты и другие клетки. Они использовали эти органоиды для изучения не только развития кишечника человека, но и возникновения врожденных кишечных расстройств ^[14]. Впоследствии они расширили свою модель, которая открыла возможности для изучения внеклеточных автономных механизмов, управляющих развитием ЖКТ и заболеваниями, такими как болезнь Гиршпрунга, характеризующаяся врожденным отсутствием кишечных нервов ^[15].

Кишечные органоиды также стали эффективной платформой для моделирования кишечных заболеваний, вызванных хроническим воспалением или физической травмой, включая воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), синдром короткой кишки, целиакию и муковисцидоз ^[16]. ВЗК является сложным многофакторным заболеванием, обусловленным нарушением регуляции врожденных и адаптивных иммунных реакций против антигенов, присутствующих в ЖКТ. А изучение ВЗК на трехмерной многоклеточной модели раскрыло критическую роль эпителиальных клеток кишечника в развитии заболевания и позволило расшифровать in vitro многоклеточное поддержание целостности кишечного барьера ^[17].

Для исследований в области нейробиологии также часто использую трехмерные клеточные модели. Например, органоиды человеческого мозга способны воспроизводить многие аспекты раннего развития этого органа. Эти структуры имитируют мозг плода по клеточному составу, с выявленными типами нейронов-предшественников и глиальных клеток, а также общей структурой тканей и траекторией их развития ^[18]. До разработки этой технологии получить представление о развитии in vivo было возможно только на моделях животных или тканях плода. Оба метода влекут за собой значительные ограничения, первый не в полной мере отражает сложность центральной нервной системы человека, в то время как второй относительно недоступен. Таким образом, появление органоидной технологии в сочетании с передовой геномной инженерией предоставило уникальную возможность моделировать развитие и функционирование человеческого мозга и изучать заболевания нервной системы.

В последние годы были разработаны органоиды следующего поколения - ассемблоиды. Эти модели могут объединять несколько органов и/или клеточных линий в трехмерной культуре. Они являются особенно ценным инструментом в нейробиологии, поскольку могут быть использованы для моделирования взаимодействий между различными областями мозга или различными компонентами ЦНС или периферической нервной системы, фиксации межклеточных взаимодействий и изучения сборки нейронных цепей. Органоиды, полученные от пациента, могут быть подвергнуты генетическим манипуляциям или инфицированы патогенами и впоследствии использованы в ассемблоидах для изучения болезнетворных процессов в контексте человека.

Несколько групп создали мультирегиональные ассемблоиды путем слияния органоидов, напоминающих дорсальный и вентральный передний мозг ^[19-23]. Эта модель была использована для изучения траектории развития, миграции нейронов и дальнейших взаимодействий между кортикальными глутаматергическими нейронами и гамкергическими интернейронами. Более того, получая сборки переднего мозга от пациентов с синдромом Тимоти, расстройством развития нервной системы, продемонстрировали дефект миграции интернейронов.

Проблемы и ограничения

Органоиды и ассемблоиды все чаще используются для моделирования взаимодействий между типами клеток в процессе развития и болезни. Несмотря на очевидный потенциал этих трехмерных многоклеточных систем в моделировании метаболических, кишечных и неврологических заболеваний, все еще существует множество ограничений, которые необходимо тщательно учитывать.

Во-первых, создание таких систем может быть длительным, сложным, дорогостоящим и трудоемким процессом. Кроме того, остаются важные проблемы, связанные с воссозданием в многоклеточных системах точных копий тканевого микроокружения in vivo, таких как межтканевой интерфейс, пространственно-временное распределение газов, питательных веществ и отходов, а также механическое микроокружение.

В большинстве доступных на данный момент примеров трехмерные многоклеточные системы лучше воспроизводят ранние стадии развития, а не зрелые фенотипы взрослых особей, и демонстрируют высокую гетерогенность между партиями. Отчасти это связано с проблемами длительного хранения культур, когда органоиды образуют некротические ядра из-за недостаточной проницаемости для питательных веществ по мере их роста.

Кроме того, пробелы в понимании органогенеза in vivo и архитектуры тканей приводят к неполному или неточному созданию многоклеточных систем, влияя на клеточное разнообразие, специфичность, созревание и организацию. Действительно, органогенез основан на сложном взаимодействии множества типов клеток из разных линий и васкуляризации, которых часто не хватает органоидам.

Таким образом, трехмерные многоклеточные системы требуют оптимизации, и применение биопечати в этой области может стать решением многих проблем, с которыми эта область сталкивается в настоящее время. Биопечать действительно является инновационной технологией, которая позволяет собирать множество биологических компонентов (клеток и биоматериалов) в точном соотношении, интегрировать сосудистую сеть, обеспечивать высокую пропускную способность и воспроизводимость ^[24].

3D-биопечать

Что такое трехмерная печать? Это разновидность аддитивного производства, которая создает 3D-объекты путем нанесения последовательных слоев материала с цифровым управлением. Ну а для биопечати используются живые клетки и другие необходимые компоненты.

Ещё в 2016 году управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило несколько систем, напечатанных на 3D-принтере, для клинического использования, такие как импланты или протезы. Однако на сегодняшний день большинство медицинских применений 3D-печати связаны со статичными неживыми конструкциями, предназначенными для функционирования в качестве структурных или заполняющих пространство протезов.

Последние разработки в области проектирования и изготовления неживых имплантируемых конструкций, напечатанных на 3D-принтере, иллюстрируют потенциал технологии 3D-печати для производства передовых устройств, специфичных для конкретного пациента.

Однако, биопечать живых клеточных конструкций столкнулась со значительными препятствиями:

• переход от синтетических материалов к биологически функциональным материалам при сохранении контроля над механическими свойствами на микро— и макроуровне; 
• создание конструкций тканей с физиологической гетерогенностью;
• разработка методов получения и дифференцировки функциональных клеток из стволовых клеток;
• сопряжение биопринтированных тканей с физиологической сетью сосудов.

Тканям, напечатанным на 3D-принтере, на доклинической стадии разработки все еще не хватает основных функциональных элементов, таких как сосудистая сеть, иннервация, лимфатические сосуды, а также количества и разнообразия функциональных и поддерживающих типов клеток, необходимых для больших тканей и сложных органов.

Однако сейчас возможности 3D-биопечати находятся на той стадии, когда из множества биоматериалов и типов клеток уже можно создавать конструкции, приближающиеся к клинически значимым размерам и геометрии. Ткани, напечатанные с помощью 3D-биопечати, такие как хрящи, кости и кожа, демонстрируют потенциал этой технологии (Рис.2).

Рис.2. Биопечать хрящей, костей и кожных тканей.
А - напечатанные на 3D-принтере хрящевые структуры анатомической формы (человеческое ухо слева; и мениск овцы справа) ^[25].
В – Биопечать кальвариальной структуры человеческого масштаба, пригодной для реконструкции лица. Визуализированная программа для 3D-печати конструкции кальвариальной кости (зеленым и красным обозначены пути подачи, соответственно, полимерной смеси и насыщенного клетками гидрогеля) (вверху слева). Фотография напечатанной конструкции (слева). Имплантация в область дефекта кальвариальной кости у крыс (вверху справа). Конструкция через 5 месяцев после имплантации (в центре справа). Гистологическое изображение конструкции через пять месяцев после имплантации (внизу) ^[26].
C – Концепция биопечати кожи in situ. Сначала раны сканируются (i) для получения точной информации о топографии раны (ii), которая затем направляет печатающие головки для размещения определенных материалов (iii) и/или типов клеток (iv) в соответствующих местах ^[27].
D - Биопринтер кожи. Сканирование раны с помощью ручного сканера ZScanner Z700 (вверху слева). Геометрическая информация, полученная при сканировании, затем вводится в программное обеспечение для ориентации отсканированных изображений в стандартной системе координат (вверху справа). Отсканированные данные с их системой координат используются для определения объема заливки и точек траектории для головки сопла (внизу слева). Биопечать (внизу справа) ^[27].

Чтобы представить, как будущие достижения повлияют на следующее поколение тканей, напечатанных на 3D-принтере, мы можем взглянуть на современные технологии 3D-печати конструкций из хрящей, костей и кожи (Рис.2). Они могут служить ориентирами для оценки состояния технологии биопечати. Понимая факторы, которые способствовали их успеху, и предвосхищая достижения в области биопечати материалов и клеток, можно предположить, какие из существующих ограничений могут быть преодолены в краткосрочной перспективе и каково будет влияние на разработку следующего поколения тканей, напечатанных на 3D-принтере.

Общие свойства успешно напечатанных на 3D-принтере тканей включают:

• воспроизведение трехмерной архитектуры, размера и формы нативных тканей;
• ткани обладают соответствующими механическими свойствами на микро- и макроуровне
• ткани включают типы клеток, необходимые для функционирования и поддержания тканевого гомеостаза 
• воспроизведение функции ткани или органа на уровне, достаточном для замены, восстановления или дополнения ткани in vivo.

Кроме того, дальнейшее развитие биопринтеров может ускорить сроки изготовления и обеспечить разрешение, необходимое для изготовления функциональных тканей в клинически значимых масштабах.

А также прогресс в направлении многомасштабного и многокомпонентного изготовления клинически значимых тканей и органов при помощи биопечати может потребовать новых исследований в области работы со стволовыми клетками, разработки «умных» биоматериалов и интеграции дополнительных технологий биопечати, например сложного программного обеспечения или даже искусственного интеллекта.

Искусственный интеллект для 3D печати органов

Итак, как мы уже выяснили, 3D-биопечать – очень интересная, но при этом достаточно сложная задача. К счастью, с быстрым развитием технологии искусственного интеллекта (ИИ) некоторые алгоритмы, применяемые для 3D-печати, могут существенно помочь исследователям.

Например, ИИ может применяться для эффективной и высокопроизводительной обработки изображений, прогнозирования пригодности материалов для печати, оптимизации параметров печати, интеллектуального мониторинга процесса печати, а также оперативного мониторинга и прогнозирования готового продукта ^[28].

Заключение

Создание органов на сегодняшний день становится уже более реальной задачей, однако всё еще присутствуют проблемы и ограничения, которые учёным только предстоит разрешить.

Также в данной области важно междисциплинарное взаимодействие исследователей из различных областей, инженеров и IT-специалистов. Ну а команда SkyGen будет рада помочь вам и предоставить различные решения и технологии для ваших экспериментов!

В данный момент в нашем каталоге вы найдёте продукты для исследований в области клеточной биологии:

• питательные среды и факторы роста Thermo FS, Sigma-Aldrich, NeoFroxx, Himedia;
• антитела Thermo FS, GenScript и Sigma-Aldrich;
• автоматические счетчики клеток SOL и Countess III;
• микроскопы Magnus и MShot; 
• культуральный пластик;
• и многое другое!

Если вам нужна помощь в подборе реагентов и оборудования, отправьте заявку на sales@skygen.com и наши специалисты помогут выбрать подходящую продукцию.

Список литературы

1. Duval K., Grover H., Han L.-H., Mou Y., Pegoraro A. F., Fredberg J., et al. (2017). Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology 32, 266–277. 10.1152/physiol.00036.2016

2. Huh D., Hamilton G. A., Ingber D. E. (2011). From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21, 745–754. 10.1016/j.tcb.2011.09.005

3. Knight E., Przyborski S. (2015). Advances in 3D cell culture technologies enabling tissue-like structures to be created in vitro . J. Anat. 227, 746–756. 10.1111/joa.12257

4. Goldrick C, Guri I, Herrera-Oropeza G, O'Brien-Gore C, Roy E, Wojtynska M, Spagnoli FM. 3D multicellular systems in disease modelling: From organoids to organ-on-chip. Front Cell Dev Biol. 2023 Feb 2;11:1083175. doi: 10.3389/fcell.2023.1083175

5. Li M. L., Aggeler J., Farson D. A., Hatier C., Hassell J., Bissell M. J. (1987). Influence of a reconstituted basement membrane and its components on casein gene expression and secretion in mouse mammary epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 136–140. 10.1073/pnas.84.1.136

6. Sato T., Vries R. G., Snippert H. J., van de Wetering M., Barker N., Stange D. E., et al. (2009). Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature 459, 262–265. 10.1038/nature07935

7. Barreiro Carpio M., Dabaghi M., Ungureanu J., Kolb M. R., Hirota J. A., Moran-Mirabal J. M. (2021). 3D bioprinting strategies, challenges, and opportunities to model the lung tissue microenvironment and its function. Front. Bioeng. Biotechnol. 9, 773511. 10.3389/fbioe.2021.773511

8. Shi Z.-D., Tarbell J. M. (2011). Fluid flow mechanotransduction in vascular smooth muscle cells and fibroblasts. Ann. Biomed. Eng. 39, 1608–1619. 10.1007/s10439-011-0309-2

9. Park S. E., Georgescu A., Huh D. (2019). Organoids-on-a-chip. Science 364, 960–965. 10.1126/science.aaw7894

10. Ewart L., Apostolou A., Briggs S. A., Carman C. v., Chaff J. T., Heng A. R., et al. (2022). Performance assessment and economic analysis of a human Liver-Chip for predictive toxicology. Commun. Med. 2, 154. 10.1038/s43856-022-00209-1

11. Nikolaev M., Mitrofanova O., Broguiere N., Geraldo S., Dutta D., Tabata Y., et al. (2020). Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature 585, 574–578. 10.1038/s41586-020-2724-8

12. Takebe T., Wells J. M. (2019). Organoids by design. Science 364, 956–959.

13. Eicher A. K., Kechele D. O., Sundaram N., Berns H. M., Poling H. M., Haines L. E., et al. (2022). Functional human gastrointestinal organoids can be engineered from three primary germ layers derived separately from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 29, 36–51.e6. 10.1016/j.stem.2021.10.010

14. Spence J. R., Mayhew C. N., Rankin S. A., Kuhar M. F., Vallance J. E., Tolle K., et al. (2011). Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro . Nature 470, 105–109. 10.1038/nature09691

15. Workman M. J., Mahe M. M., Trisno S., Poling H. M., Watson C. L., Sundaram N., et al. (2017). Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nat. Med. 23, 49–59. 10.1038/nm.4233

16. Fair K. L., Colquhoun J., Hannan N. R. F. (2018). Intestinal organoids for modelling intestinal development and disease. Philosophical Trans. R. Soc. B Biol. Sci. 373, 20170217. 10.1098/rstb.2017.0217

17. Okamoto R., Watanabe M. (2016). Investigating cell therapy for inflammatory bowel disease. Expert Opin. Biol. Ther. 16, 1015–1023. 10.1080/14712598.2016.1177019

18. Lancaster M. A., Renner M., Martin C.-A., Wenzel D., Bicknell L. S., Hurles M. E., et al. (2013). Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature 501, 373–379. 10.1038/nature12517

19. Bagley J. A., Reumann D., Bian S., Lévi-Strauss J., Knoblich J. A. (2017). Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat. Methods 14, 743–751. 10.1038/nmeth.4304

20. Birey F., Andersen J., Makinson C. D., Islam S., Wei W., Huber N., et al. (2017). Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature 545, 54–59. 10.1038/nature22330

21. Xiang Y., Tanaka Y., Patterson B., Kang Y.-J., Govindaiah G., Roselaar N., et al. (2017). Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell 21, 383–398.e7. 10.1016/j.stem.2017.07.007

22. Sloan S. A., Andersen J., Pașca A. M., Birey F., Pașca S. P. (2018). Generation and assembly of human brain region–specific three-dimensional cultures. Nat. Protoc. 13, 2062–2085. 10.1038/s41596-018-0032-7

23. Birey F., Li M.-Y., Gordon A., Thete M. v., Valencia A. M., Revah O., et al. (2022). Dissecting the molecular basis of human interneuron migration in forebrain assembloids from Timothy syndrome. Cell Stem Cell 29, 248–264.e7. 10.1016/j.stem.2021.11.011

24. Murphy S. v., de Coppi P., Atala A. (2020). Opportunities and challenges of translational 3D bioprinting. Nat. Biomed. Eng. 4, 370–380. 10.1038/s41551-019-0471-7

25. Markstedt, K. et al. 3D bioprinting human chondrocytes with nanocellulose–alginate bioink for cartilage tissue engineering applications. Biomacromolecules 16, 1489–1496 (2015).

26. Kang, H.-W. et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity. Nat. Biotechnol. 34, 312–319 (2016).

27. Albanna, M. et al. In situ bioprinting of autologous skin cells accelerates wound healing of extensive excisional full-thickness wounds. Sci. Rep. 9, 1856 (2019).

28. Ma L, Yu S, Xu X, Moses Amadi S, Zhang J, Wang Z. Application of artificial intelligence in 3D printing physical organ models. Mater Today Bio. 2023 Sep 15;23:100792. doi: 10.1016/j.mtbio.2023.100792. PMID: 37746667; PMCID: PMC10511479.