Как учёные секвенируют с Vazyme

Single-cell профилирование и молекулярный анализ длинных некодирующих РНК в зародышевых клетках человека выявили, что LNC1845 влияет на фактор транскрипции LHX8 ^[2].

Некодирующие РНК (lncRNAs) выполняют разнообразные функции во многих типах клеток. Например, они играют большую роль в формировании зародышевых клеток, регулируя экспрессию факторов транскрипции. Данное исследование выявило влияние LNC1845 на фактор транскрипции LHX8, который необходим для развития фолликулов яичников. Это исследование представляет большой интерес для репродуктивных биологов и изучения функций некодирующих РНК.

• Для секвенирования РНК использовали Набор VAHTS® Universal V8 RNA-seq для создания библиотек РНК (Illumina).

Митохондриальный фактор транскрипции STAT5A способствует метаболическому ремоделированию и эффекту Варбурга путем инактивации комплекса пируватдегидрогеназы ^[3]. 

STAT5A является классическим фактором транскрипции, который играет ключевую роль в различных биологических процессах, включая инициацию и прогрессирование опухоли. Часть STAT5A локализована в митохондриях, но биологические функции митохондриального STAT5A остаются неясными. В этом исследовании учёные показывают, что STAT5A взаимодействует с комплексом пируватдегидрогеназы, соединяющим два ключевых метаболических пути: гликолиз и цикл трикарбоновых кислот. Митохондриальный STAT5A нарушает целостность пируватдегидрогеназы, тем самым подавляя его активность и ремоделируя клеточный гликолиз и окислительное фосфорилирование. Митохондриальная транслокация STAT5A усиливается в условиях гипоксии. Это усиливает эффект Варбурга в раковых клетках и способствует росту клеток in vitro в условиях гипоксии и росту опухоли in vivo. Эти результаты указывают на проонкогенную роль STAT5A в энергетическом метаболизме, которая отличается от его классической функции в качестве фактора транскрипции. 

• Для ПЦР использовали набор ChamQ SYBR qPCR Master Mix 

Протокол для оценки доступности хроматина в растениях при помощи ATAC-seq ^[4]. 

Доступные регионы генома являются первичными позициями для связывания транскрипционных факторов и регуляции хроматина. В этом исследовании учёные разработали протокол для создания библиотек для ATAC-seq в тканях Arabidopsis thaliana и пайплайн для биоинформатического анализа. Их протокол также применим и к тканям других растений и может использоваться для оценки доступности хроматина в растениях для изучения их роста и развития. 

• Для создания ATAC-seq библиотек использовали Набор TruePrep® Flexible DNA для создания библиотек ДНК (Illumina) и Набор TruePrep® Index Kit V2 для мультиплексирования библиотек Illumina. 

Первое сообщение о заражении батата вирусом мозаики Ёкай в Китае ^[5]. 

Батат (Dioscorea opposita Thunb.) культивируют в Китае для употребления в пищу и использования в медицине. В настоящее время около 15 родов вирусов могут заражать растения батата и приводить к гибели культуры. В июле 2020 года было проведено обследование вирусных заболеваний батата на плантациях провинции Хэнань, Китай. Было собрано 54 образца листьев с мозаичностью для дальнейшего анализа, в ходе которого было обнаружено заражение растений вирусом мозаики Ёкай. Это был первый случай, зарегистрированный в Китае, когда этот вирус нашли в тканях батата.

• Для удаления рРНК использовали Ribo-off® набор для деплеции рРНК

Создание клеточного ландшафта аксолотля с использованием гибридизационного single-cell секвенирования ^[6]. 

Мексиканский аксолотль (Ambystoma mexicanum) – хороший модельный объект для исследований регенерации и развития. Примечательно, что неотенические аксолотли могут подвергаться метаморфозу в различных органах, который сопровождается постепенным снижением их способности к регенерации и продолжительности жизни. Однако этот процесс все еще слабо изучен на молекулярном уровне. В этом исследовании учёные провели профилирование экспрессии генов более чем в 1 миллионе отдельных клеток в 19 типах тканей, чтобы создать клеточный ландшафт взрослого акчолотля. Сравнение таких профилей между тканями неотенических и метаморфизованных аксолотлей выявило гетерогенность неиммунных паренхиматозных клеток в разных тканях и установило их регуляторную сеть. Кроме того, учёным удалось описать динамические паттерны экспрессии генов во время развития конечностей у неотенических аксолотлей. Этот анализ молекулярных характеристик неотенических и метаморфизованных аксолотлей служит источником для изучения молекулярной идентичности аксолотля и способствует лучшему пониманию метаморфоза.

• Для очистки ДНК использовали Магнитные частицы VAHTS для ДНК
• Для создания библиотек ДНК для Illumina использовали Набор TruePrep® Flexible DNA для создания библиотек ДНК (Illumina)
• Для создания библиотек ДНК для MGI использовали Набор VAHTS® Circularization для создания кольцевых библиотек MGI

Расшифровка пространственной организации хроматина и динамических эпигенетических ландшафтов клеток-макрофагов во время дифференцировки и иммунной активации ^[7]. 

Иммуноциты динамически перепрограммируют профили экспрессии своих генов во время дифференцировки и иммунореактивности. Однако лежащий в основе механизм остается неуловимым. В данном исследовании учёные используют метод single cell Hi-C для создания динамического эпигенетического атласа макрофагов во время этих процессов. Эта работа предоставляет 3D-структуры генома иммуноцитов и проливает свет на порядок организации генома и скоординированную транскрипцию генов во время иммунореакции.

• Для создания библиотек РНК для RNA-seq использовали Набор VAHTS® Universal V8 RNA-seq для создания библиотек РНК (Illumina)
• Для создания библиотек для ATAC-seq использовали Набор TruePrep® Flexible DNA для создания библиотек ДНК (Illumina) и Набор TruePrep® Index Kit V2 для мультиплексирования библиотек Illumina
• Для single cell амплификации и очистки использовали ДНК полимеразу Phi29 MAX и Магнитные частицы VAHTS для ДНК 

BRPF1 соединяет H3K4me3 и H3K23ac в эмбриональных стволовых клетках человека и необходим для плюрипотентности ^[8]. 

Посттрансляционные модификации гистонов играют важную роль в принятии решений о судьбе клетки во время развития. Однако то, как именно эти модификации распознаются и координируются, пока полностью неизвестно. В этой работе учёные показали, что BRPF1 - белок, связывающий мультигистоны, необходим для плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток человека.

• Для создания библиотек РНК для RNA-seq использовали Набор VAHTS® Universal V8 RNA-seq для создания библиотек РНК (Illumina)
• Для пробоподготовки библиотек использовали Набор VAHTS Universal DNA для создания библиотек ДНК (Illumina)

Взаимодействия между эпителиальными клетками хозяина и Acinetobacter baumannii способствуют появлению штаммов с высокой устойчивостью к антибиотикам и мукоидностью ^[9].

Acinetobacter baumannii является важным внутрибольничным патогеном, который хорошо адаптируется к среде хозяина, но механизм этой адаптации пока неизвестен. В данной работе учёные создали in vitro систему для эволюции A. baumannii, что позволило изучить лежащий в основе адаптации патогена механизма. В результате эксперимента, под влиянием эпителиальных клеток легкого у патогена возникали мутации, которые изменяли восприимчивость к противомикробным агентам, понижали адгезию клеток и повышали антифагоцитарную способность. Это открытие пролило свет на представление о влиянии реакции хозяина на эволюцию A. baumannii.

• Для пробоподготовки библиотек использовали Набор TruePrep® Flexible DNA для создания библиотек ДНК (Illumina)

Распространенное, но непостоянное заражение грибов, ассоциированными с растениями, растительными вирусами ^[10].

Ранее эта группа учёных выяснила, что патогенный гриб картофеля Rhizoctonia solani подвергается инфицированию растительным РНК-вирусом рода Cucumovirus. В данной работе исследователи определили распространение заражения грибов растительными вирусами. Их результаты показали, что среди 169 протестированных штаммов грибов около 50% были носителями вирусов растений, а многие из штаммов содержали несколько видов вирусов. Секвенирование ДНК грибов показало, что большинство штаммов грибов, содержащих вирусы растений, были связаны с растительными патогенными и/или эндофитными грибами, принадлежащими к родам Alternaria, Lecanicillium и Sarocladium. Эти наблюдения свидетельствуют о том, что непостоянное заражение грибами вирусов растений может часто происходить в природе. Эти результаты подчеркивают возможную роль грибов в жизненном цикле, распространении и эволюции вирусов растений.

• Для удаления рРНК использовали Ribo-off® набор для деплеции рРНК
• Для очистки использовали Магнитные частицы VAHTS для РНК
  

Защитные эффекты и регуляторные пути мелатонина на модели мышей с черепно-мозговой травмой: анализ транскриптома и биоинформатический анализ ^[11]. 

Черепно-мозговая травма (ЧМТ) является ведущей причиной инвалидности и смертности во всем мире. Мелатонин - нейроэндокринный гормон, синтезируемый шишковидной железой, который помогает при ЧМТ, однако, точный механизм такого действия до конца не изучен. В этом исследовании учёные изучили защитный эффект и регуляторные пути мелатонина на модели мышей с ЧМТ, используя анализ транскриптома и биоинформатический анализ. Исследователям удалось построить регуляторную сеть и продемонстрировать регуляторную взаимосвязь между некодирующими РНК и мРНК. Их данные дают новое представление о молекулярном эффекте лечения мелатонином после ЧМТ и предполагают, что высокопроизводительное секвенирование и анализ транскриптомов полезны для изучения механизмов действия лекарств при лечении после ЧМТ.

• Для удаления рРНК использовали Ribo-off® набор для деплеции рРНК

Влияние пренатального воздействия фталата и физических упражнений в детстве на материнское поведение у самок крыс в послеродовой период: роль метилирования Oxtr в гипоталамусе ^[12]. 

Известно, что окситоцин вовлечен в пути возникновения материнского поведения. Эпигенетическая модификация гена рецептора окситоцина (OXTR) посредством метилирования ДНК связана с патогенезом нервно-психических расстройств. Целью этого исследования было изучение влияния пренатального воздействия ди(2-этилгексил) фталата на регулируемое окситоцином поведение матери и изучение защитного эффекта физических упражнений. Результаты показали, что у самок, подвергшихся пренатальному воздействию DEHP, наблюдалось снижение активности по поиску малышей без значительного изменения стрессовых реакций. Пренатальное воздействие DEHP снижало экспрессию окситоцина, мРНК Oxtr и рецептора окситоцина и увеличивало метилирование Oxtr в гипоталамусе самок крыс в послеродовом периоде. Не было выявлено существенного влияния физических упражнений на поведенческие, биохимические и эпигенетические показатели. Эти результаты свидетельствуют о том, что пренатальное воздействие DEHP оказывает долгосрочное неблагоприятное воздействие на поведение матери; гиперметилирование Oxtr может быть потенциальным эпигенетическим механизмом этого изменения, которое нельзя предотвратить физическими упражнениями в детстве.

• Для создания библиотек ДНК для Illumina использовали Набор RNA Multiplex Oligos Set 1/2 для мультиплексирования библиотек Illumina

1. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977;74(12):5463-5467. doi:10.1073/pnas.74.12.5463
2. Nan Wang, Jing He, Xiaoyu Feng, Shengyou Liao, Yi Zhao, Fuchou Tang, Kehkooi Kee (2023) Single-cell profiling of lncRNAs in human germ cells and molecular analysis reveals transcriptional regulation of LNC1845 on LHX8 eLife 12:e78421 https://doi.org/10.7554/eLife.78421
3. Zhang, L., Zhang, J., Liu, Y. et al. Mitochondrial STAT5A promotes metabolic remodeling and the Warburg effect by inactivating the pyruvate dehydrogenase complex. Cell Death Dis 12, 634 (2021). https://doi.org/10.1038/s41419-021-03908-0 
4. Fu-Xiang Wang, Guan-Dong Shang, Lian-Yu Wu, Yan-Xia Mai, Jian Gao, Zhou-Geng Xu, Jia-Wei Wang, Protocol for assaying chromatin accessibility using ATAC-seq in plants, STAR Protocols, Volume 2, Issue 1, 2021, 100289, ISSN 2666-1667, https://doi.org/10.1016/j.xpro.2020.100289.
5. Qin Y, Wang F, Cai L, Gao S, Wen Y, Liu Y, Lu C, Yang J, Li X, Qi W, Zhang H, Wang F. First Report of Youcai Mosaic Virus Infecting Yam in China. Plant Dis. 2022 Aug 30. doi: 10.1094/PDIS-05-22-1026-PDN. Epub ahead of print. PMID: 36040228.
6. Ye, F., Zhang, G., E., W. et al. Construction of the axolotl cell landscape using combinatorial hybridization sequencing at single-cell resolution. Nat Commun 13, 4228 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31879-z 
7. Lin, D., Xu, W., Hong, P. et al. Decoding the spatial chromatin organization and dynamic epigenetic landscapes of macrophage cells during differentiation and immune activation. Nat Commun 13, 5857 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33558-5 
8. Zhang C, Lin H, Zhang Y, Xing Q, Zhang J, Zhang D, Liu Y, Chen Q, Zhou T, Wang J, Shan Y, Pan G. BRPF1 bridges H3K4me3 and H3K23ac in human embryonic stem cells and is essential to pluripotency. iScience. 2023 Jan 5;26(2):105939. doi: 10.1016/j.isci.2023.105939. PMID: 36711238; PMCID: PMC9874078.
9. Zhang W, Yao Y, Zhou H, He J, Wang J, Li L, Gao M, Liu X, Shi Y, Lin J, Liu J, Chen H, Feng Y, Zhou Z, Yu Y, Hua X. Interactions between host epithelial cells and Acinetobacter baumannii promote the emergence of highly antibiotic resistant and highly mucoid strains. Emerg Microbes Infect. 2022 Dec;11(1):2556-2569. doi: 10.1080/22221751.2022.2136534. PMID: 36227610; PMCID: PMC9621264.
10. Cao, X.; Liu, J.; Pang, J.; Kondo, H.; Chi, S.; Zhang, J.; Sun, L.; Andika, I.B. Common but Nonpersistent Acquisitions of Plant Viruses by Plant-Associated Fungi. Viruses 2022, 14, 2279. https://doi.org/10.3390/v14102279 
11. Fu Jiayuanyuan, Zhou Qiang, Wu Biying, Huang Xuekang, Tang Zhaohua, Tan Weilin, Zhu Ziyu, Du Mengran, Wu Chenrui, Ma Jun, Balawi Ehab, Liao Z. B. Protective effects and regulatory pathways of melatonin in traumatic brain injury mice model: Transcriptomics and bioinformatics analysis. Frontiers in Molecular Neuroscience, vol. 15, 2022. doi: 10.3389/fnmol.2022.974060
12. Lee, Y.-J.; Lin, H.-T.; Chaudhary, M.A.; Lee, Y.-C.; Wang, D.-C. Effects of Prenatal Phthalate Exposure and Childhood Exercise on Maternal Behaviors in Female Rats at Postpartum: A Role of Oxtr Methylation in the Hypothalamus. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 9847. https://doi.org/10.3390/ijms22189847