Реактивы, оборудование и
расходные материалы
для лабораторий
8 (800) 333-12-26 [email protected]
пн-пт: 9:30-18:00 по МСК

Как учёные секвенируют с Vazyme

27.02.2023

За последние 50 лет с момента открытия первого метода секвенирования (Сэнгер, 1977[1]) технологии продвинулись далеко вперед: сейчас NGS применяется на том или ином этапе практически в каждом исследовании; количество методик и производителей оборудования и реагентики неустанно растёт; а NGS не обошло ни одну область биологи. В этом обзоре мы хотим рассказать о самых популярных наборах для NGS от Vazyme и показать многообразие областей, для которых учёные выбирают эти реагенты.

У Vazyme широкий выбор реагентов:

  • Наборы для подготовки библиотек на любых платформах (Illumina®, MGI®, Ion Torrent®, ONT)
  • Адаптеры
  • Частицы для очистки VAHTS
  • Контроль качества и количества продуктов (Qubit, qPCR)

Гайд по подбору реагентов


Подготовка библиотек ДНК

Наборы для создания библиотек ДНК от Vazyme можно разделить на 3 группы: на основе физической или ферментативной фрагментации и фрагментации транспозазой Tn5. Наборы каждой группы доступны для секвенирования на платформах Illumina®, MGI®, Ion Torrent®.

Наборы на основе физической фрагментации

Для пробоподготовки библиотек ДНК при помощи физической фрагментации подойдут наборы:

Набор VAHTS Universal DNA для создания библиотек ДНК ( Illumina, MGI)
Набор VAHTS® Universal Pro DNA для создания библиотек ДНК (Illumina, MGI)
Набор VAHTS® Universal DNA V2 для создания библиотек ДНК (Ion Torrent)
ND607.png
Характеристики:
  • Высокая эффективность лигирования адаптеров, меньше потери при создании библиотек;
  • Удобные мастермиксы снижают вероятность ошибок;
  • От 100 пг до 4 мкг: широкий диапазон исходной ДНК;
  • Подходит для работы с фрагментированной ДНК, сцДНК, FFPE образцов, ChIP ДНК и ампликонов.

Также для физической фрагментации рекомендуем использовать соникатор Bioruptor® Pico от Diagenode.

Система для фрагментации ДНК для пробоподготовки NGS Соникатор Bioruptor® Pico.jpg Характеристики:
  • Фрагментация с возможностью получения фрагментов размером от 150 до 1 000 п.о. 
  • Области применения: исследования окружающей среды, токсикология, геномика и эпигеномика, исследования в области онкологии, стволовых клеток, неврологии и многое другое.
  • Возможна обработка различных объемов биоматериала (диапазон от 20 мкл до 2 мл) в количестве до 16 проб за один запуск прибора.

К прибору прилагаются совместимые расходные материалы, а также наборы для фрагментации.


Наборы на основе ферментативной фрагментации

Для пробоподготовки библиотек ДНК при помощи ферментативной фрагментации подойдут наборы:

Набор VAHTS Universal Plus DNA для создания библиотек ДНК ( Illumina, MGI) ND617.png
Характеристики:
  • От 100 пг до 1 мкг: широкий диапазон исходной ДНК;
  • Применение: полногеномное, метагеномное секвенирование, совместим с панелями для таргетного секвенирования.
Набор VAHTS® Universal Plus V2 DNA для создания библиотек ДНК ( Illumina, MGI) ND627.png
Характеристики:
  • Снижено количество химерных прочтений;
  • Более надежное определение вариаций (SNV, InDel, SV).

Адаптеры

Адаптеры Illumina MGI
Full адаптер
Единичные индексы
Набор адаптеров VAHTS® DNA Set 1/2
индекс по 6 п.н.
Набор адаптеров VAHTS DNA Set 8
индекс по 10 п.н.
Набор адаптеров VAHTS® DNA Set 3-6
индекс по 8 п.н.
Stubby адаптер
Уникальные двойные индексы
Двойной UMI (5 - 6 нуклеотидов)
Набор VAHTS® Dual UMI UDI Set 1-4
индекс по 8 п.н.
Набор VAHTS® Dual UMI UDB Set 1-8
индекс по 10 п.н.


Наборы на основе транспозазной фрагментации

В наборах серии TruePrep используется новый метод фрагментации ДНК, основанный на транспозазах, который превращает утомительные этапы фрагментации ДНК, восстановления концов и лигирования адаптеров в простую одностадийную реакцию. Значительно снижается необходимое количество исходной матрицы ДНК и сокращается время подготовки библиотеки.

TD501-02.pngДля платформы Illumina наборы представлены в четырех вариантах, которые подходят для работы с разными диапазонами исходной ДНК (500 нг, 50 нг, 5 нг и 1 нг).

Набор для платформы MGI позволяет работать с исходной ДНК в количестве 100 пг - 500 нг.

Адаптеры

Адаптеры Illumina MGI
Stubby адаптер Набор TruePrep® Index Kit V4
единичные индексы по 8 п.н.
Набор TruePrep® Index Kit
единичные индексы по 10 п.
Набор TruePrep® Index Kit V2
двойные индексы по 8 п.н.


Подготовка библиотек РНК

Обогащение образцов РНК

Частицы для обогащения мРНК

N401.png

Частицы VAHTS® для обогащения мРНК это парамагнитные микросферы размером 1 мкм, связанные с олиго(dT).

Подходят для выделения поли(А)+ РНК из образцов очищенной тотальной РНК.

Технология магнитной сепарации позволяет отделить мРНК от образцов небольшого объема, избегая этапа осаждения.

Весь процесс может быть завершен в течение 1 часа.

Ribo-off наборы для деплеции рРНК

N406.png

Набор для удаления рРНК Ribo-off подходит для удаления рРНК из образца тотальной РНК, сохраняя мРНК и все виды некодирующих РНК. 

Набор подходит как для интактных, так и для частично деградированных образцов РНК (в том числе FFPE РНК), а полученные продукты подходят для создания библиотек РНК и других экспериментов.

Есть три вида наборов для работы с образцами различного происхождения:

  • Набор "Человек/мышь/крыса" подходит для удаления рРНК из общей РНК человека, мыши и крысы (включая цитоплазматическую 28S, 18S, 5S рРНК и митохондриальную 12S, 5,8S рРНК).
  • Набор "Бактерия" подходит для удаления рРНК (включая 16S и 23S рРНК) из 1 - 5 мкг тотальной РНК грамположительных и грамотрицательных бактерий.
  • Набор "Растения" подходит для удаления рРНК (включая 5S, 18S и 25S рРНК) из тотальной РНК корней, семян и листьев растений. Диапазон исходного материала: от 1 до 5 мкг тотальной растительной РНК.

Набор Ribo-off® набор для деплеции глобиновой и рибосомальной РНК позволит удалить глобиновую мРНК и рРНК из тотальной РНК из образцов крови. 

Диапазон исходного материала: от 0,01 до 1 мкг общей РНК выделенной из крови. Глобиновая мРНК и рРНК (включая цитоплазматическую и митохондриальную рРНК) удаляются из тотальной РНК, оставляя мРНК и некодирующие РНК. Набор подходит как для интактных, так и для частично деградированных образцов РНК, а полученные продукты пригодны для создания библиотеки РНК и других экспериментов.

Создание библиотек РНК

NR605.JPG

Набор VAHTS® Universal V8 RNA-seq для создания библиотек РНК ( Illumina, MGI) предназначен для пробоподготовки библиотек мРНК, он совместим с модулями для поли(А) обогащения мРНК и рРНК деплеции.

Характеристики:

  • Универсальный: содержит реагенты для цепь-специфичного секвенирования и не специфичного.
  • Надежный: высокий выход библиотек кДНК
  • Быстрый: совмещает синтез второй цепи кДНК, восстановление концов и dA-тейлинг в одной реакции
Адаптеры Illumina MGI
Full адаптер Набор адаптеров VAHTS RNA Set 1/2
единичные индексы по 6 п.н.
Набор адаптеров VAHTS RNA Set 8
единичные индексы по 10 п.н.
Набор адаптеров VAHTS RNA Set 3-6
единичные индексы по 8 п.
Stubby адаптер Набор RNA Multiplex Oligos Set 1/2
двойные индексы по 8 п.н.
-

NR801.png 

Набор VAHTS® Small RNA для создания библиотек малых РНК (Illumina) предназначен для пробоподготовки библиотек малых РНК. Диапазон исходной матрицы от 100 пг до 1 мкг тотальной РНК. Этот набор подходит для работы с тотальной РНК животных и растений, а также с уже выделенной и очищенной малой РНК.

Протокол включает лигирование адаптеров на 3'- и 5'-концы малой РНК, а затем этапы обратной транскрипции, ПЦР-амплификации и очистки. Набор содержит все ферменты и буферы, необходимые для создания библиотеки. Также доступны дополнительные индексы

Все компоненты наборов прошли строгий контроль качества и функциональную проверку, чтобы обеспечить максимальную стабильность и воспроизводимость конструкции библиотеки.

Наборы для создания кольцевых библиотек MGI

NM201.JPG

Набор VAHTS® Circularization Kit для MGI — это модуль, который используется для создания кольцевой одноцепочечной библиотеки секвенирования на платформе MGI. Исходной матрицей служат продукты ПЦР после присоединения линкера-адаптера.


А ещё мы собрали статьи по направлениям биологии, в которых учёные использовали реагенты для пробоподготовки к NGS.

Биология развития

Single-cell профилирование и молекулярный анализ длинных некодирующих РНК в зародышевых клетках человека выявили, что LNC1845 влияет на фактор транскрипции LHX8 [2].

Некодирующие РНК (lncRNAs) выполняют разнообразные функции во многих типах клеток. Например, они играют большую роль в формировании зародышевых клеток, регулируя экспрессию факторов транскрипции. Данное исследование выявило влияние LNC1845 на фактор транскрипции LHX8, который необходим для развития фолликулов яичников. Это исследование представляет большой интерес для репродуктивных биологов и изучения функций некодирующих РНК.

Биохимия

Митохондриальный фактор транскрипции STAT5A способствует метаболическому ремоделированию и эффекту Варбурга путем инактивации комплекса пируватдегидрогеназы [3]

STAT5A является классическим фактором транскрипции, который играет ключевую роль в различных биологических процессах, включая инициацию и прогрессирование опухоли. Часть STAT5A локализована в митохондриях, но биологические функции митохондриального STAT5A остаются неясными. В этом исследовании учёные показывают, что STAT5A взаимодействует с комплексом пируватдегидрогеназы, соединяющим два ключевых метаболических пути: гликолиз и цикл трикарбоновых кислот. Митохондриальный STAT5A нарушает целостность пируватдегидрогеназы, тем самым подавляя его активность и ремоделируя клеточный гликолиз и окислительное фосфорилирование. Митохондриальная транслокация STAT5A усиливается в условиях гипоксии. Это усиливает эффект Варбурга в раковых клетках и способствует росту клеток in vitro в условиях гипоксии и росту опухоли in vivo. Эти результаты указывают на проонкогенную роль STAT5A в энергетическом метаболизме, которая отличается от его классической функции в качестве фактора транскрипции. 

Ботаника

Протокол для оценки доступности хроматина в растениях при помощи ATAC-seq [4]

Доступные регионы генома являются первичными позициями для связывания транскрипционных факторов и регуляции хроматина. В этом исследовании учёные разработали протокол для создания библиотек для ATAC-seq в тканях Arabidopsis thaliana и пайплайн для биоинформатического анализа. Их протокол также применим и к тканям других растений и может использоваться для оценки доступности хроматина в растениях для изучения их роста и развития. 

Вирусология

Первое сообщение о заражении батата вирусом мозаики Ёкай в Китае [5]

Батат (Dioscorea opposita Thunb.) культивируют в Китае для употребления в пищу и использования в медицине. В настоящее время около 15 родов вирусов могут заражать растения батата и приводить к гибели культуры. В июле 2020 года было проведено обследование вирусных заболеваний батата на плантациях провинции Хэнань, Китай. Было собрано 54 образца листьев с мозаичностью для дальнейшего анализа, в ходе которого было обнаружено заражение растений вирусом мозаики Ёкай. Это был первый случай, зарегистрированный в Китае, когда этот вирус нашли в тканях батата.

Зоология

Создание клеточного ландшафта аксолотля с использованием гибридизационного single-cell секвенирования [6]

Мексиканский аксолотль (Ambystoma mexicanum) – хороший модельный объект для исследований регенерации и развития. Примечательно, что неотенические аксолотли могут подвергаться метаморфозу в различных органах, который сопровождается постепенным снижением их способности к регенерации и продолжительности жизни. Однако этот процесс все еще слабо изучен на молекулярном уровне. В этом исследовании учёные провели профилирование экспрессии генов более чем в 1 миллионе отдельных клеток в 19 типах тканей, чтобы создать клеточный ландшафт взрослого акчолотля. Сравнение таких профилей между тканями неотенических и метаморфизованных аксолотлей выявило гетерогенность неиммунных паренхиматозных клеток в разных тканях и установило их регуляторную сеть. Кроме того, учёным удалось описать динамические паттерны экспрессии генов во время развития конечностей у неотенических аксолотлей. Этот анализ молекулярных характеристик неотенических и метаморфизованных аксолотлей служит источником для изучения молекулярной идентичности аксолотля и способствует лучшему пониманию метаморфоза.

Иммунология

Расшифровка пространственной организации хроматина и динамических эпигенетических ландшафтов клеток-макрофагов во время дифференцировки и иммунной активации [7]

Иммуноциты динамически перепрограммируют профили экспрессии своих генов во время дифференцировки и иммунореактивности. Однако лежащий в основе механизм остается неуловимым. В данном исследовании учёные используют метод single cell Hi-C для создания динамического эпигенетического атласа макрофагов во время этих процессов. Эта работа предоставляет 3D-структуры генома иммуноцитов и проливает свет на порядок организации генома и скоординированную транскрипцию генов во время иммунореакции.

Клеточная биология

BRPF1 соединяет H3K4me3 и H3K23ac в эмбриональных стволовых клетках человека и необходим для плюрипотентности [8]

Посттрансляционные модификации гистонов играют важную роль в принятии решений о судьбе клетки во время развития. Однако то, как именно эти модификации распознаются и координируются, пока полностью неизвестно. В этой работе учёные показали, что BRPF1 - белок, связывающий мультигистоны, необходим для плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток человека.

Микробиология

Взаимодействия между эпителиальными клетками хозяина и Acinetobacter baumannii способствуют появлению штаммов с высокой устойчивостью к антибиотикам и мукоидностью [9].

Acinetobacter baumannii является важным внутрибольничным патогеном, который хорошо адаптируется к среде хозяина, но механизм этой адаптации пока неизвестен. В данной работе учёные создали in vitro систему для эволюции A. baumannii, что позволило изучить лежащий в основе адаптации патогена механизма. В результате эксперимента, под влиянием эпителиальных клеток легкого у патогена возникали мутации, которые изменяли восприимчивость к противомикробным агентам, понижали адгезию клеток и повышали антифагоцитарную способность. Это открытие пролило свет на представление о влиянии реакции хозяина на эволюцию A. baumannii.

Микология

Распространенное, но непостоянное заражение грибов, ассоциированными с растениями, растительными вирусами [10].

Ранее эта группа учёных выяснила, что патогенный гриб картофеля Rhizoctonia solani подвергается инфицированию растительным РНК-вирусом рода Cucumovirus. В данной работе исследователи определили распространение заражения грибов растительными вирусами. Их результаты показали, что среди 169 протестированных штаммов грибов около 50% были носителями вирусов растений, а многие из штаммов содержали несколько видов вирусов. Секвенирование ДНК грибов показало, что большинство штаммов грибов, содержащих вирусы растений, были связаны с растительными патогенными и/или эндофитными грибами, принадлежащими к родам Alternaria, Lecanicillium и Sarocladium. Эти наблюдения свидетельствуют о том, что непостоянное заражение грибами вирусов растений может часто происходить в природе. Эти результаты подчеркивают возможную роль грибов в жизненном цикле, распространении и эволюции вирусов растений.

Нейробиология

Защитные эффекты и регуляторные пути мелатонина на модели мышей с черепно-мозговой травмой: анализ транскриптома и биоинформатический анализ [11]

Черепно-мозговая травма (ЧМТ) является ведущей причиной инвалидности и смертности во всем мире. Мелатонин - нейроэндокринный гормон, синтезируемый шишковидной железой, который помогает при ЧМТ, однако, точный механизм такого действия до конца не изучен. В этом исследовании учёные изучили защитный эффект и регуляторные пути мелатонина на модели мышей с ЧМТ, используя анализ транскриптома и биоинформатический анализ. Исследователям удалось построить регуляторную сеть и продемонстрировать регуляторную взаимосвязь между некодирующими РНК и мРНК. Их данные дают новое представление о молекулярном эффекте лечения мелатонином после ЧМТ и предполагают, что высокопроизводительное секвенирование и анализ транскриптомов полезны для изучения механизмов действия лекарств при лечении после ЧМТ.

Этология

Влияние пренатального воздействия фталата и физических упражнений в детстве на материнское поведение у самок крыс в послеродовой период: роль метилирования Oxtr в гипоталамусе [12]

Известно, что окситоцин вовлечен в пути возникновения материнского поведения. Эпигенетическая модификация гена рецептора окситоцина (OXTR) посредством метилирования ДНК связана с патогенезом нервно-психических расстройств. Целью этого исследования было изучение влияния пренатального воздействия ди(2-этилгексил) фталата на регулируемое окситоцином поведение матери и изучение защитного эффекта физических упражнений. Результаты показали, что у самок, подвергшихся пренатальному воздействию DEHP, наблюдалось снижение активности по поиску малышей без значительного изменения стрессовых реакций. Пренатальное воздействие DEHP снижало экспрессию окситоцина, мРНК Oxtr и рецептора окситоцина и увеличивало метилирование Oxtr в гипоталамусе самок крыс в послеродовом периоде. Не было выявлено существенного влияния физических упражнений на поведенческие, биохимические и эпигенетические показатели. Эти результаты свидетельствуют о том, что пренатальное воздействие DEHP оказывает долгосрочное неблагоприятное воздействие на поведение матери; гиперметилирование Oxtr может быть потенциальным эпигенетическим механизмом этого изменения, которое нельзя предотвратить физическими упражнениями в детстве.

Как видите, многообразие приложений и задач, для которых можно использовать реагенты Vazyme крайне велико. Даже, если вашей области нет в этом списке, это не значит, что мы не сможем подобрать отличные реагенты для вашего эксперимента. 

Отправьте свою заявку на [email protected] и мы подберём идеальное решение для ваших задач.

Смотреть весь каталог Vazyme

Список литературы
  1. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977;74(12):5463-5467. doi:10.1073/pnas.74.12.5463
  2. Nan Wang, Jing He, Xiaoyu Feng, Shengyou Liao, Yi Zhao, Fuchou Tang, Kehkooi Kee (2023) Single-cell profiling of lncRNAs in human germ cells and molecular analysis reveals transcriptional regulation of LNC1845 on LHX8 eLife 12:e78421 https://doi.org/10.7554/eLife.78421
  3. Zhang, L., Zhang, J., Liu, Y. et al. Mitochondrial STAT5A promotes metabolic remodeling and the Warburg effect by inactivating the pyruvate dehydrogenase complex. Cell Death Dis 12, 634 (2021). https://doi.org/10.1038/s41419-021-03908-0 
  4. Fu-Xiang Wang, Guan-Dong Shang, Lian-Yu Wu, Yan-Xia Mai, Jian Gao, Zhou-Geng Xu, Jia-Wei Wang, Protocol for assaying chromatin accessibility using ATAC-seq in plants, STAR Protocols, Volume 2, Issue 1, 2021, 100289, ISSN 2666-1667, https://doi.org/10.1016/j.xpro.2020.100289.
  5. Qin Y, Wang F, Cai L, Gao S, Wen Y, Liu Y, Lu C, Yang J, Li X, Qi W, Zhang H, Wang F. First Report of Youcai Mosaic Virus Infecting Yam in China. Plant Dis. 2022 Aug 30. doi: 10.1094/PDIS-05-22-1026-PDN. Epub ahead of print. PMID: 36040228.
  6. Ye, F., Zhang, G., E., W. et al. Construction of the axolotl cell landscape using combinatorial hybridization sequencing at single-cell resolution. Nat Commun 13, 4228 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31879-z 
  7. Lin, D., Xu, W., Hong, P. et al. Decoding the spatial chromatin organization and dynamic epigenetic landscapes of macrophage cells during differentiation and immune activation. Nat Commun 13, 5857 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33558-5 
  8. Zhang C, Lin H, Zhang Y, Xing Q, Zhang J, Zhang D, Liu Y, Chen Q, Zhou T, Wang J, Shan Y, Pan G. BRPF1 bridges H3K4me3 and H3K23ac in human embryonic stem cells and is essential to pluripotency. iScience. 2023 Jan 5;26(2):105939. doi: 10.1016/j.isci.2023.105939. PMID: 36711238; PMCID: PMC9874078.
  9. Zhang W, Yao Y, Zhou H, He J, Wang J, Li L, Gao M, Liu X, Shi Y, Lin J, Liu J, Chen H, Feng Y, Zhou Z, Yu Y, Hua X. Interactions between host epithelial cells and Acinetobacter baumannii promote the emergence of highly antibiotic resistant and highly mucoid strains. Emerg Microbes Infect. 2022 Dec;11(1):2556-2569. doi: 10.1080/22221751.2022.2136534. PMID: 36227610; PMCID: PMC9621264.
  10. Cao, X.; Liu, J.; Pang, J.; Kondo, H.; Chi, S.; Zhang, J.; Sun, L.; Andika, I.B. Common but Nonpersistent Acquisitions of Plant Viruses by Plant-Associated Fungi. Viruses 2022, 14, 2279. https://doi.org/10.3390/v14102279 
  11. Fu Jiayuanyuan, Zhou Qiang, Wu Biying, Huang Xuekang, Tang Zhaohua, Tan Weilin, Zhu Ziyu, Du Mengran, Wu Chenrui, Ma Jun, Balawi Ehab, Liao Z. B. Protective effects and regulatory pathways of melatonin in traumatic brain injury mice model: Transcriptomics and bioinformatics analysis. Frontiers in Molecular Neuroscience, vol. 15, 2022. doi: 10.3389/fnmol.2022.974060
  12. Lee, Y.-J.; Lin, H.-T.; Chaudhary, M.A.; Lee, Y.-C.; Wang, D.-C. Effects of Prenatal Phthalate Exposure and Childhood Exercise on Maternal Behaviors in Female Rats at Postpartum: A Role of Oxtr Methylation in the Hypothalamus. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 9847. https://doi.org/10.3390/ijms22189847