Реактивы, оборудование и
расходные материалы
для лабораторий
8 (800) 333-12-26 [email protected]
пн-пт: 9:30-18:00 по МСК

5 способов фрагментации ДНК для NGS

10.03.2023

Подготовка качественной ДНК-библиотеки играет важную роль в секвенировании следующего поколения (NGS). Первым основным этапом NGS-пробоподготовки является фрагментация. В этом обзоре мы расскажем о 5 способах фрагментации ДНК, их особенностях, преимуществах и недостатках.

Все технологии NGS можно объединить одной характеристикой – это секвенирование коротких ридов, поэтому на входе должны быть фрагменты ДНК определенного размера, в зависимости от платформы секвенирования (обычно 300 – 600 п.о.). Это ставит перед исследователями задачу: как именно порезать выделенную геномную ДНК на кусочки заданного размера.

схема фрагментации.png

Существует три группы методов, к которым прибегают учёные для решения этой задачи:

  • Физическая фрагментация
  • Ферментативная фрагментация
  • Химическая фрагментация

Физическая фрагментация

Методы физической фрагментации используют физические силы для разрыва ковалентных связей в молекулах ДНК. Когда обе нити разрываются, ДНК фрагментируется на более мелкие кусочки. Соответственно, для создания таких физических сил используют соникацию/акустическую фрагментацию и небулизацию.

Соникация, или обработка ультразвуком, позволяет генерировать ультразвуковые волны, которые и разрушают ковалентные связи в ДНК, причем разрывы вносятся произвольным образом. Различная интенсивность и продолжительности обработки позволяют получить фрагменты желаемой длины. Для выполнения этой задачи потребуется специальный прибор – соникатор.

Соникаторы бывают двух видов – прямого и непрямого воздействия. Соникаторы прямого действия погружаются в образец и воздействуют на него изнутри, а при использовании соникаторов непрямого действия, образцы в пробирках помещаются в водяную баню внутри прибора.

соникаторы.png

Для молекулярно-биологических задач лучше подходят соникаторы непрямого действия, поскольку они более приспособлены к работе с образцами малого объема, также они не вспенивают и не нагревают образец, а фактор кросс-контаминации здесь отсутствует.

Система для фрагментации ДНК для пробоподготовки NGS Соникатор Bioruptor® Pico.jpg Для пробоподготовки ДНК-библиотек отлично подойдет соникатор Bioruptor® Pico (Diagenode), он позволяет получить фрагменты размером от 150 до 1000 п.о. Благодаря широкому выбору расходных материалов, возможна обработка различных объемов биоматериала (диапазон от 20 мкл до 2 мл) в количестве до 16 проб за один запуск прибора.

Встроенная система охлаждения (Bioruptor® Cooler) обеспечивает высокоточный контроль температуры, что предотвращает перегрев и агрегацию образцов. Прибор оснащен удобным интерфейсом, в котором как предустановлены стандартные протоколы обработки, так и реализована возможность тонкой настройки параметров под конкретные задачи. Подробная информация по использованию прибора представлена в инструкции.

Сравнение параметров соникатора Bioruptor, соникатора конкурента и погружных соникаторов: сравнение соникаторов.JPG

При небулизации используется сжатый газ, который проталкивает образец через пору определенного диаметра, что приводит к фрагментации ДНК. Таким способом можно получить фрагменты длиной от 100 до 3000 п.о, однако он приводит к серьезным потерям исходного материала и используется редко.

Ферментативная фрагментация

Ферментативная фрагментация использует особые ферменты, которые режут ДНК – эндонуклеазы. Здесь существует два метода: использование неспецифичных ДНКаз или тагментация

Как правило, для обычной ферментативной фрагментации используются ферменты ДНКаза I и фрагментаза. Они неспецифично связываются с последовательностями ДНК и вносят разрез на расстоянии до 8 нуклеотидов от сайта связывания. Достичь нужной длины фрагментов ДНК можно, изменяя время инкубации с эндонуклеазами: чем дольше время инкубации – тем меньше фрагменты будут получены. 

Тагментация – это метод ферментативной фрагментации при помощи транспозазы. Транспозаза одновременно разрезает ДНК и присоединяет к фрагментам адаптеры c обеих сторон. Дальнейший этап ПЦР использует эти адаптеры как праймеры, чтобы амплифицировать фрагменты ДНК и добавить больше адаптеров.

тагментация.png

Основное преимущество тагментации заключается в том, что этапы фрагментации и лигирования адаптеров объединены в одну реакцию. Однако, для этого метода необходим этап ПЦР, что может вызвать некоторые ошибки, связанные с амплификацией. Исследователи могут использовать в работе готовые наборы для пробоподготовки библиотек методом тагментации или раствор транспозаз с адаптерами для Illumina или без них.

Химическая фрагментация

Метод химической фрагментации относительно прост и доступен, для него используются гидроксильные радикалы, возникающие в ходе реакции: Fe2+(EDTA4−) + H2O2 →Fe3+(EDTA4−) + OH•. Они нарушают стэкинг-взаимодействия в молекулах ДНК и приводят к разрывам молекулы из-за вторичных реакций. Однако, радикалы также могут повреждать нуклеотидные остатки на концах разрезов, что может затруднять дальнейшее присоединение адаптеров.

сравнение фрагментаций.png

Шведские учёные провели сравнение всех трёх методов фрагментации, отсеквенировав геном фага лямбда [3]. На графике выше видно, что все методы фрагментации показывают схожие данные, которые также коррелируют с GC-составом. 

 Есть ещё один метод химической фрагментации, но он чаще используется для образцов РНК. Для такого эксперимента используют катионы двухвалентных металлов, таких как магний или цинк, совместно с нагреванием образца. Чем больше время инкубации – тем меньше фрагменты можно получить.

химичческая фрагментация ДНК.png

Сравнение и выводы

Мы рассмотрели 5 способов фрагментации ДНК, но какой именно использовать – решать только вам! У каждого метода есть свои преимущества и недостатки, теперь поговорим о них поподробнее.

Параметр Физическая фрагментация Ферментативная фрагментация Химическая фрагментация
Позволяет получить фрагменты заданной длины да да да
Нужно оборудование да нет нет
Нужны реагенты нет да да
Производительность зависит от прибора да да
Скорость зависит от производительности да да
Требования к исходному образцу низкие высокие низкие

Физическая фрагментация более толерантна к качеству исходного образца и позволяет получить более гомогенную по размеру фрагментов библиотеку, а также вносит разрывы более рандомно относительно ферментативной фрагментации. Однако, для физической фрагментации потребуется оборудование. Ферментативный и химический методы фрагментации более доступны из-за отсутствия необходимости приобретать оборудование, однако нужно будет заказывать реагенты. Также ферментативный метод может резать ДНК не совсем произвольно, и может отличаться воспроизводимость экспериментов, если используются разные смеси ферментов. Однако, для некоторых видов экспериментов эти нюансы не столь критичны. Химический способ фрагментации относительно прост и более доступен, однако может потребоваться дополнительная репарация концов фрагментов для более эффективного присоединения адаптеров.

Если удалось выбрать желаемый способ фрагментации, то можно сразу сузить спектр подходящих наборов для пробоподготовки ДНК-библиотек:

Наборы на основе физической фрагментации

ND607.png Набор VAHTS Universal DNA для создания библиотек ДНК ( Illumina, MGI)
Набор VAHTS® Universal Pro DNA для создания библиотек ДНК (Illumina, MGI)
Набор VAHTS® Universal DNA V2 для создания библиотек ДНК (Ion Torrent)

Характеристики:
- Высокая эффективность лигирования адаптеров, меньше потери при создании библиотек;
- Удобные мастермиксы снижают вероятность ошибок;
- От 100 пг до 4 мкг: широкий диапазон исходной ДНК;
- Подходит для работы с фрагментированной ДНК, сцДНК, FFPE образцов, ChIP ДНК и ампликонов.

Наборы на основе ферментативной фрагментации

ND617.png Набор VAHTS Universal Plus DNA для создания библиотек ДНК ( Illumina, MGI)

Характеристики:
- От 100 пг до 1 мкг: широкий диапазон исходной ДНК;
- Применение: полногеномное, метагеномное секвенирование, совместим с панелями для таргетного секвенирования.

Набор VAHTS® Universal Plus V2 DNA для создания библиотек ДНК ( Illumina, MGI)

Характеристики:
- Снижено количество химерных прочтений;
- Более надежное определение вариаций (SNV, InDel, SV).

Наборы на основе тагментации TD501-02.pngДля платформы Illumina наборы представлены в четырех вариантах, которые подходят для работы с разными диапазонами исходной ДНК (500 нг, 50 нг, 5 нг и 1 нг).
Набор для платформы MGI позволяет работать с исходной ДНК в количестве 100 пг - 500 нг.




Выбор реагентов большой, однако мы сможем предложить идеальное решение для любой задачи! 

Отправьте свою заявку на [email protected] и наши специалисты подберут подходящие реагенты и оборудование.

Список литературы
  1. HENRIK I. ELSNER and ERIK B. LINDBLAD. Ultrasonic Degradation of DNA. DNA.Dec 1989.697-701.http://doi.org/10.1089/dna.1989.8.697 
  2. Nelly Sapojnikova, Nino Asatiani, Tamar Kartvelishvili, Lali Asanishvili, Vitaly Zinkevich, Irina Bogdarina, Julian Mitchell, Abdulmohsen Al-Humam, A comparison of DNA fragmentation methods − Applications for the biochip technology, Journal of Biotechnology, Volume 256, 2017, Pages 1-5, ISSN 0168-1656, https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2017.06.1202.
  3. P. Gyarmati, Y. Song, J. Hällman, M. Käller, Chemical fragmentation for massively parallel sequencing library preparation, Journal of Biotechnology, Volume 168, Issue 1, 2013, Pages 95-100, ISSN 0168-1656,https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2013.08.020
  4. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/BID/Technical-Notes/dna-fragmentation-next-generation-seq...
  5. https://blog.genohub.com/2016/07/22/fragmentation-of-dna-rna-for-next-gen-sequencing-library-prep/
  6. https://www.diagenode.com/files/posters/Fast_Accurate_DNA_Shearing_with_Bioruptor_NGS%20_Poster.pdf