#40 Секвенирование ДНК и фрагментарный анализ методом капиллярного электрофореза

Секвенирование по Сэнгеру - метод секвенирования ДНК, основанный на селективном включении терминирующих дидезоксинуклеотидов ДНК-полимеразой во время репликации ДНК in vitro. 

Этот метод был разработан Фредериком Сэнгером и его коллегами в 1977 г. и, несмотря на появление массового параллельного секвенирования (NGS), метод Сэнгера остается золотым стандартом секвенирования и широко используется для небольших проектов или валидации результатов NGS. 

Флуоресцентный анализ фрагментов ДНК является одним из самых востребованных методов в молекулярной биологии. Метод с очень высоким разрешением и воспроизводимостью измеряет относительный размер фрагментов ДНК методом капиллярного электрофореза (КЭ) флуоресцентно меченых фрагментов ДНК на автоматическом генетическом анализаторе, использующем флуоресцентные стандарты размеров для сравнения.

Секвенирование по Сэнгеру включает несколько последовательных этапов работы. В портфеле SkyGen есть реагенты для каждого из них, и данный обзор поможет понять какие реагенты требуются именно для вашего эксперимента.

NimaGen - голландская компания, поставляющая альтернативные реактивы для секвенаторов Applied Biosystems. 

В портфолио NimaGen входят различные наборы, буферы и стандарты, совместимые с платформами ABI: 

• Генетические анализаторы 3100 Avant (4 капилляра) и 3100 (16 капилляров)
• Генетические анализаторы 3130 (4 капилляра) и 3130XL (16 капилляров)
• Генетические анализаторы 3500 (8 капилляров) и 3500XL (24 капилляра)
• Анализаторы ДНК 3730 (48 капилляров) и 3730XL (96 капилляров)
• Генетический анализатор SeqStudio (4 капилляра

Капиллярный электрофорез: этапы работы

На первом этапе необходимо выделить и очистить ДНК и амплифицировать интересующие фрагменты. Затем очистить реакционную смесь от остатков праймеров и невключенных в цепь дезоксинуклеотидфосфатов. Для некоторых приложений этот этап необязателен. 

После проверки качества очистки и оценки количества ДНК можно приступить к реакции терминирующего секвенирования: введения флуоресцентной метки в фрагменты ДНК разной длины, которые будут далее анализироваться на одной из платформ. Фрагменты разной длины образуются благодаря обрыву цепи во время ПЦР, который происходит во время встраивания флуоресцентно меченых дидезоксинуклеотидов, так называемых красителей-терминаторов. 

После проведения реакции секвенирования грамотная очистка образца обеспечивает стабильность высокого качества результатов секвенирования. 

Последним этапом является проведение капиллярного электрофореза, и, по желанию, очистка капилляров. Для ABI анализаторов потребуется заполнить капилляры вашего прибора полимером, тип которого зависит от прибора и задач эксперимента. Между собой полимеры отличаются процентным содержанием диметилакриламида.

Преимущества полимеров от Nimagen:

• Полимеры полностью аналогичны полимерам серии POP, при этом позволяют сэкономить средства.
• Полимеры были протестированы ведущими научными центрами Москвы и Новосибирска.
• Позволяют успешно разделять пики в составе гомополимеров после 900 п.о.
• Возможность начать использовать полимер, не меняя существующий рабочий модуль, и с использованием стандартного протокола и методики.
• Нет необходимости новой спектральной калибровки прибора.

Для работы также потребуются буферные растворы для капиллярного электрофореза: буферные растворы NimaPOP 10x с ЭДТА для использования с полимерами NimaPOP.

Кроме перечисленных выше реактивов, доступны также стандарты длин ДНК, раствор для очистки ирегенрации капилляров и раствор формамида.

Очистка ПЦР реакции

AmpliClean™

AmpliClean™ - это набор для очистки нуклеиновых кислот с помощью магнитных частиц. Подходит для стандартной очистки и отбора фрагментов по размеру. 

AmpliClean™ удаляет соли, праймеры, димеры праймеров и дНТФ, оставляя ультра-чистую ДНК необходимой длины. Очищенные продукты могут быть использованы для последующих применения, таких как секвенирование по Сэнгеру, NGS и анализ на микрочипах. 

Гибкий протокол удобен для ручной очистки, а также позволяет легко запрограммировать любую систему автоматизированной раскапки.

• Стабильная очистка ампликонов размером более 100 п.н.
• Эффективное и полное удаление контаминирующих веществ: праймеров, солей и дНТФ
• Получение высокостабильных ПЦР продуктов при 4 °C

Рисунок 1. Схема работы AmpliClean™

ExS-Pure™

Набор ExS-Pure™ создан для быстрой и простой ферментативной очистки продуктов ПЦР от праймеров и остатков дНТФ. 

Набор состоит из двух рекомбинантных гидролаз: экзонуклеазы I и щелочной фосфотазы креветки. Это сочетание позволяет разрушить все нежелательные остатки нуклеотидов, которые могут отрицательно повлиять на качество дальнейшего анализа, например при поиске SNP, генотипировании или клонировании. 

• 5-минутный протокол; 
• Удаляет праймеры и дНТФ в продуктах ПЦР;
• Реакция в 1 пробирке;
• Новейшее поколение термолабильных ферментов;
• Легко включается в автоматизированные процессы; 
• 100% восстановление образца.

Принцип работы

Экзонуклеаза I имеет сильную 3’-экзонуклеазную активность. Вступая в реакцию при 37 ºC, фермент деградирует одноцепочечные праймирующие олигонуклеотиды, но не оказывает никакого влияния на двуцепочечные фрагменты. Щелочная фосфотаза креветки деактивирует дНТФ, удалением 5’-фосфата. Оба фермента полностью инактивируются при нагревании реакционной смеси до 90 ºC за 1 минуту. Комбинация двух ферментов обеспечивает полную очистку реакции без необходимости смены буфера. 

Простейший протокол 

Минимальное время работы: просто добавьте ExS-Pure™ к ПЦР-продукту и процесс очистки пройдет в течении 5 минут в стандартном термоциклере. 

100% восстановление образца 

С ExS-Pure™ нет необходимости прибегать к трудоемким и дорогостоящим методам очистки, таким как гель-электрофорез, колоночная или магнитная очистка. И короткие, и длинные фрагменты ДНК остаются интактными после обработки.

Максимальное качество данных 

Секвенирование ДНК, анализ SNP и многие другие применения требуют тщательной очистки продуктов ПЦР. При секвенировании ДНК, не включённые в цепь дНТФ и остатки праймеров могут вызвать высокий уровень шума и неправильное прочтение нуклеотидов. С ExS-Pure™ вы эффективно удалите эти загрязнения и увеличите длину прочтения и качество обработки данных.

Высокое качество секвенирования после обработки ExS-Pure™

Рисунок 2. Образец хроматограммы, полученной после секвенирования с помощью набора BrilliantDye® v1.1 и полимера NimaPOP-7 на генетическом анализаторе 3130.

Реакция терминирующего секвенирования

BrilliantDye® 

BrilliantDye® - линейка наборов для реакции терминирующего секвенирования. 

• Совместимы со всеми типами анализаторов ABI.
• Доступны наборы для химии версий 1.1 и 3.1, а также дГТФ версии 1.1 и 3.1.

Формат 

Наборы поставляются в виде готовых премиксов с концентрацией 2,5Х. Реагенты полностью оптимизированы для полного соответствия химии, подходят для всех приложений секвенирования, включая секвенирование de novo и ресеквенирование. Наборы генерируют данные с равномерной высотой пиков и оптимизированным балансом сигналов для получения длинных, качественных прочтений. 

Доступны две версии 

Набор BrilliantDye® Terminator v1.1 разработан для приложений, требующих оптимального прочтения нуклеотидов близко к праймерам. BrilliantDye® Terminator v3.1. – идеально подойдет для получения длинных прочтений. 

Совместимость 

Нет необходимости менять протоколы, настройки и калибровки. Наборы совместимы с генетическими анализаторами ABI моделей 310, 3100, 3130, 3500, 3730 и серии SeqStudio, а также анализатором КЭ Promega Spectrum. Нет необходимости менять протоколы, настройки и калибровки. 

Вам также может потребоваться очистка D-Pure ™ или iX-Pure ™ DyeTerminator Cleanup, полимеры NimaPOP ™ и рабочие буферы, энзим ExS-Pure ™, система очистки ПЦР и регенерации капиллярного массива ReCap. 

Состав набора 

Наборы для секвенирования BrilliantDye® Terminator Cycle содержат все необходимые компоненты реагента для реакции секвенирования в виде готового премикса:

• Премикс для секвенирования
• Буфер для секвенирования, 5Х
• Контроль pGem
• Праймер M13 (-21)

Также доступны BrilliantDye® с дГТФ, версии 1.1 и 3.1. Для секвенирования G- и GT-богатых матриц, NimaGen предлагает наборы BrilliantDye® с дГТФ, оптимизирующие прочтение сложных матриц, заменяя dITP с dGTP.

Полимеры для капиллярного электрофореза

NimaPOP™ 

• Высокое разрешение и воспроизводимость
• Долгий срок хранения
• Совместимы с генетическими анализаторами Applied Biosystems™
• Не требуют дополнительных настроек и калибровок

Высокотехнологичные полимерные матрицы для фрагментного анализа методом капиллярного электрофореза: 

NimaPOP™4 для секвенирования коротких фрагментов ДНК (до 500 п.н.). Часто используется для фрагментного анализа в криминалистике и других приложениях. 

NimaPOP™6 для секвенирования коротких фрагментов ПЦР, обеспечивает наилучшее разрешение в близкой к праймеру зоне. Рекомендуем использовать совместно с BrilliantDye® Terminator v1.1 

NimaPOP™7 позволяет секвенировать фрагменты длинной около 1000 п.н., например плазмиды, совместно с BrilliantDye® Terminator v3.1.

Полимеры NimaPOP™ не требуют никаких изменений в протоколах, условиях реакции и не нуждаются в спектральной калибровке. Разработанные с использованием новейшей химии полимеров, NimaPOP™ проявляют лучшую стабильность и разрешающую способность. 

Совместимость 

Полимеры доступны в разных форматах:

Очистка секвенирующей реакции

iX-Pure™ 

Набор для очистки iX-Pure™ — это быстрый метод очистки реакций секвенирования ДНК, удаляющих DyeTerminators и соли. Очистка занимает менее 40 минут и требует минимум рабочего времени лаборанта. 

Совместимость 

Эти реагенты можно добавлять в виде премикса или последовательно. Совместимость с модулями запуска BigDye XTerminator. 

Важно удалить загрязнения, особенно не инкорпорированные красители ddNTP, после окончания реакции секвенирования. Плохая очистка приводит к снижению качества сигнала и интерференции пиков, что приводит к невозможности считывания результатов. 

Существуют различные механизмы для очистки реакций секвенирования. В данном наборе реализован метод, в котором загрязняющие вещества связываются со специальными смолами и осаждаются на дне пробирки. В другом механизме целевые продукты связываются с магнитными частицами и отделяются от загрязнителей. Кроме того, для очистки можно использовать метод осаждения ДНК этанолом. Однако последний метод крайне трудоемкий и важно оценивать эффективность различных методов и выбирать наиболее подходящий под ваши задачи.

D-Pure™ 

D-Pure™ - набор для удаления красителей терминаторов с помощью магнитных частиц после реакции циклического секвенирования (BigDye® или BrilliantDye® terminator v1.1 или 3.1). 

Подходит для низко- и высокопроизводительных процессов. С помощью этих магнитных частиц вы можете легко удалить остатки красителя-терминатора из реакции, как ручным методом, так и автоматизированным. Не требует этапов центрифугирования или фильтрации.

Высокое качество

Реакции секвенирования очищенные D-Pure ™ дают качественные хроматограммы: очень высокое отношение сигнала к шуму (S / N), отличные показатели качества и большая длина чтения со 100% удалением любых остатков красителя-терминатора.

Дополнительные продукты

Магнитные штативы Alpaqua 

Alpaqua предлагает инновационные инструменты, разработанные для ускорения таких приложений, как NGS, экстракция и очистка нуклеиновых кислот и молекулярная диагностика. 

Широкая линейка магнитных штативов, с запатентованными технологиями пружинной подушки, а также температурные блоки, SBS штативы для пробирок и держатели для микропланшетов Alpillo®.

Флуоресцентные стандарты длин ДНК

NimaGen предлагает набор бюджетных флуоресцентных стандартов длин ДНК для фрагментного анализа с красителями ROX и LIZ. 

Стандарты длин ДНК, 500 (Оранжевый и красный) являются полным аналогом GS500ROX и GS500LIZ с идертичными размерами и мобильностью. 

Стандарты длин ДНК, 600 (Оранжевый и красный) обладают улучшенными характеристиками (см. рисунок).

Наборы ReCAP™ для промывки капилляров

Одна из значительных затрат при проведении капиллярного электрофореза – замена капилляров. Из-за плохой разрешающей способности, мобильности и/или увеличенного флуоресцентного фона в одном или нескольких капиллярах, может потребоваться замена всего блока. 

Набор для промывки и регенерации капилляровReCap™ позволяет полностью восстановить старые вышедшие из строя капилляры. 

Набор может быть использован на старых блоках, со сниженным разрешением или дающих шмеры и мазки на хроматограмме. Кроме того, он очищает насос, предотвращая и удаляя признаки желтой и красной дымки. 

Набор содержит 4 различных буфера, для последовательного применения с протоколом Water Wash Wizard. 

ReCap™ помогает поддерживать оптимальную производительность, восстанавливать вышедшие из строя блоки до состояния новых. Вы увидите мгновенное улучшение качества данных и сможете избежать затрат на покупку новых капилляров.