Реактивы и оборудование
для лабораторий

# 49 ДНК-полимеразы от New England Biolabs

Почти каждому из читающих этот обзор приходится принимать решение – какую ДНК-полимеразу использовать для своего ПЦР-эксперимента? В этот момент, в поисках новых решений и идей, вы открываете список доступных полимераз, например, на сайте или в каталоге New England Biolabs, и видите, что для проведения простой амплификации ДНК можно воспользоваться более чем 125 продуктами. Это не только разные типы ДНК-полимераз, но и разные форматы, в которых они доставляются к потребителю. Сразу разбегаются глаза, и не всегда ясно, чем "Hot Start" отличается от "Master Mix"?

Поэтому, сегодняшний обзор является первой частью из двух статей и посвящен тому, как же ориентироваться на этом огромном рынке, и будет полезен в первую очередь новичкам, однако и продвинутые пользователи, надеемся, смогут по иному взглянуть на некоторые новые продукты New England Biolabs.

Фермент можно купить как отдельно, так и в виде наборов, содержащих все компоненты для постановки эксперимента

Итак, NEB сегодня предлагает большое разнообразие ДНК-полимераз и наборов с ними. Давайте на первом этапе определимся с форматами, в которых выпускаются ферменты.

Конечно же самое простое решение - это купить просто фермент, выбрав необходимое количестве единиц активности, в комплекте к нему будет прилагаться буферный раствор.

В некоторых случаях также прилагается так называемый GC-Enhancer - специальный раствор, которые добавляют, когда предстоит работа с GC-богатыми образцами. Такой раствор для улучшения работы ДНК-полимеразы, например, поставляется вместе с OneTaq/OneTaq Hot StartQ5 High-Fidelity/Q5 Hot StartPhusion High-Fidelity/Phusion Flex Hot Start ДНК-полимеразам. 

Если вы хотите сразу приобрести все компоненты реакции, которые понадобятся во время постановки эксперименты - ваш выбор - это готовый набор для проведения ПЦР. Такой набор содержит в себе в отдельных пробирках: фермент, смесь dNTP, буферный раствор без Mg2+, буферный раствор с Mg2+, раствор Mg2+, очищенную от нуклеаз воду. Приобретая такой набор, вы будете уверены, что, имея на руках образец ДНК и праймеры, вы будете способны провести эксперимент. Такая фасовка предусмотрена для Taq (также в наборе маркер длин), Q5 High Fidelity (также в наборе маркер длин, краситель для нанесения на гель, фермент в виде готовой смеси 2X), Phusion (также в наборе маркер длин, контрольный образец ДНК, смесь праймеров для контрольной реакции), LongAmp ДНК-полимераз.

Чем Master Mix отличается от Hot Start и от QuickLoad?

Другой популярный формат для поставки ДНК-полимераз - в виде готовой смеси "Master mix". В этом случае, все компоненты ПЦР реакции находятся в одной пробирке с концентрацией x2,x5: там находится сам фермент, dNTP, MgCl2, KCl, стабилизаторы. В чем преимущество такой фасовки: уменьшается вероятность совершить ошибку при раскапывании, и упрощается протокол. Практически все ДНК-полимеразы от New England Biolabs можно приобрести в формате готовой смеси: Q5/Q5 Hot StartPhusion/Phusion Flex Hot Start,LongAmp/LongAmp Hot StartOneTaq/ OneTaq Hot StartTaq.

Конечно же, в таком случае надо сразу выбирать - какой буфер должен быть добавлен - специальный для GC-богатых участков, стандартный или содержащий уже краску, так чтобы можно было реакцию сразу нанести на гель (т.н. QuickLoad). В формате QuickLoad можно приобрести готовые смеси следующих полимеразOneTaq/OneTaq Hot Start,Taq ДНК полимеразы.

При анализе многообразия продуктов для ПЦР, можно обратить внимание, что некоторые полимеразы представлены с добавлением приставки Hot Start. Это означает, что благодаря присутствию стабилизирующих антител ДНК-полимераза находится в неактивном состоянии, активируясь при нагревании, которое сопровождает денатурацию ДНК в первом цикле ПЦР. В таком виде можно найти OneTaq Hot StartHot Start TaqQ5 Hot StartPhusion Hot Start FlexLongAmp Hot Start Taq а также EpiMark Hot Start Taq.

Цель эксперимента определят выбор ДНК-полимеразы

На первом этапе выбора ДНК-полимеразы надо понять - предстоит ли делать стандартный эксперимент, ПЦР с высокой точностью или специфическую реакцию ПЦР.

Если перед нами стоит задача провести самый обычный, рутинный эксперимент - нашим выбором будут OneTaq/OneTaq Hot StartTaq/Hot Start Taq ДНК-полимеразы.

GC-богатые образцы, высокий выход и высокие требования к точности амплификации

Для экспериментов, к которым предъявляются особенно высокие стандарты точности копирования, рекомендуется использовать Q5/Q5 Hot StartPhusion/Phusion Flex ДНК-полимеразы, а для амплификации библиотек для NGS был разработан специальный продукт на основе Q5 - готовая смесь 2x для высокоточной ПЦР NEBNext . Точность ДНК-полимеразы Q5 более чем в 100 раз выше чем у полимеразы Taq, а у Phusion - более чем в 50 раз. Эти же полимеразы следует выбирать, если скорость копирования является критической величиной для эксперимента (соответственно 6000 и 4000 нуклеотидов в минуту), а расход фермента на реакцию на 25% меньше, чем у аналогичных ферментов NEB. Оба фермента обладают 3'-5' экзонуклеазной активностью. В результате амплификации получают ампликоны с тупыми концами.

Если вы планируете проводить сайт-направленный мутагенез - также выбирайте Q5 / Q5 Hot Start ДНК-полимеразу.

В то же время, VentR/Deep VentR ДНК-полимераза обладает в 5 раз более высокой точностью, чем у ДНК-полимеразы Taq, а также обладает 3'-5' экзонуклеазной активностью и оставляет после себя тупые концы.Такая термостабильная полимераза может использоваться для рутинных экспериментов, требующих более высокую точность, чем у Taq.

Если вам предстоит работать с образцами с высоким содержанием GC, в первую очередь стоит обратить внимание на Q5 /Q5 Hot StartOneTaq/OneTaq Hot Start ДНК-полимеразы. Однако если предстоит амплификация очень длинных фрагментов, длиннее 20 000 нуклеотидов, которые к тому же GC-богатые, то можно рассмотреть возможность использования LongAmp/LongAmp Hot Start Taq .

Высокий выход экспериментам обеспечат Q5/Q5 Hot StartOneTaq/OneTaq Hot StartPhusion/Phusion Flex.

Амплификация длинных фрагментов ДНК

Если перед вами стоит задача амплификации длинных фрагментов - хорошим выбором будут ДНК-полимеразы Q5/Q5 Hot StartPhusion/Phusion Flex, подтвержденная длина амплификации - до 20 000 нуклеотидов. В то же время для амплификации ультра-длинных фрагментов - до 30 000 нуклеотидов, самым оптимальным решением будет LongAmp /LongAmp Hot Start Taq ДНК-полимеразы.

С другой стороны - если длина ампликона меньше 6 000 нуклеотидов - можно остановить свой выбор на One Taq/One Taq Hot Start или Vent R/Deep Vent R, а при длине ампликона 5 000 нуклеотидов - на Taq/Hot Start Taq. Однако для Hemo Klen Taq, EpiMark Hot Start Taq пределом будет являться 2 000 и 1 000 нуклеотидов соответственно.

Теперь давайте рассмотрим ДНК-полимеразы, которые используются для реализации ПЦР со специфическими задачами:

Мультиплексная ПЦР (ПЦР с использованием множества пар праймеров одновременно)

Если перед вами стоит задача успешно провести ПЦР с несколькими парами праймеров - наш совет, в первую очередь - использовать готовую смесь для мультиплескной ПЦР 5X.

Кроме того, хорошие результаты для мультиплексной ПЦР показывает OneTaq® Hot Start ДНК-полимераза

Амплификация ДНК из образцов цельной крови человека и мыши

Hemo KlenTaq®- ваш выбор, когда требуется проводить амплификацию с образцами цельной крови, так как именно этот фермент наименее восприимчив к ингибиторам, содержащимся в крови. Это аналог Taq полимеразы, которая была адаптирована для амплификации в одной реакционной смеси с образцами цельной крови. Будет успешно использоваться для образцов крови человека и мыши, при этом содержание крови может составлять до 20% (объем реакционной смеси 25 мкл) или до 30% (объем реакционной смеси 50 мкл).

Кроме использования образцов цельной крови, возможна амплификация с использованием образцов засохшей крови, а также для удлинения праймеров. Длина амплифицируемых участков не должна превышать 2 000 нуклеотидов. Полимераза вообще не обладает экзонуклеазной активностью. После амплификации оставляет на 3'-конце на один нуклеотид больше. 

Амплификация ДНК, модифицированной бисульфитом

С такой задачей превосходно справится EpiMark Hot Start Taq ДНК-полимераза. В результате амплификации на 3'-конце остается один лишний аденозин.

ПЦР колоний клеток

Если Вам надо подтвердить наличие фрагмента ДНК в плазмиде, введенной в клетку, а также определить ориентацию введенного участка, то возможно провести ПЦР лизата клеток при помощи OneTaq ДНК-полимеразы (альтернативной возможностью является LongAmp Taq).

Заключение

Таким образом, компания New England Biolabs предоставляет возможность выбрать ДНК-полимеразу для решения практически любой задачи. Если вы все еще сомневаетесь, начните работу, используя OneTaq или Q5 ДНК-полимеразу. А тем временем мы предоставим вторую часть нашего обзора, где расскажем о ДНК-полимеразах от NEB, о которых мы не упомянули в данном тексте.

Картинка-загадка от СкайДжин!

ТЕТРАДЬ.jpg

 

к списку обзоров