Реактивы и оборудование
для лабораторий

#6 Реактивы для секвенирования по Сэнгеру и многое другое от Nimagen в Новом 2015 году

Наступает 2015 год, мы все с надеждой смотрим в будущее и верим в позитивные перемены и радостные моменты, которые ожидают нас в Новом году. Однако в то же время, огорчает повсеместная тенденция подорожания реактивов. Поэтому, в эти предпраздничные дни мы хотим еще раз обратить ваше внимание на аналоги реактивов для секвенирования на платформе ABI Genetic Analyzer, от компании Nimagen. Данные реактивы, которые позволят сэкономить значительные средства при проведении Ваших экспериментов.

Теперь, при работе на платформах ABI Genetic Analyzers 3100, 3130, 3130XL, 3500, 3500XL, 3730 & 3730XL, воспользуйтесь наборами для проведения терминирующей реакции, полимерами и буферными растворами, а также нашими новинками для улучшения качества результатов - раствором для очистки капилляров, наборами для очистки реакционной смеси после реакции секвенирования, стандартами ДНК, добавками для улучшения секвенирования GC-богатых и сложных образцов. Мы надеемся, что использование новых продуктов от Nimagen поможет получать прекрасные результаты с легкой душой, не задумываясь о растущих ценах.

Если вы планируете проведение экспериментов секвенирования по Сэнгеру, то ваша работа будет разделена не несколько этапов, на каждом из которых мы сейчас коротко остановимся, и расскажем, какие продукты потребуются для реализации каждого шага.

Платформы, на которых работают сегодня большинство исследователей, для проведения секвенирования по Сэнгеру: ABI Genetic Analyzers 310, 3100, 3130, 3130XL, 3500, 3500XL, 3730 & 3730XL. Данные приборы отличаются друг от друга прежде всего количеством капилляров, и следовательно производительностью.

Выделение исследуемого образца ДНК

На первом этапе необходимо выделить образец ДНК из вашего образца и очистить его. На данном этапе мы рекомендуем воспользоваться колоночным выделением от Bioline, или другим методом, который успешно зарекомендовал себя в ваших руках.

Реакция терминируюшего секвенирования с использованием BrightDye

После проверки качества очистки и оценки количества выделенной ДНК, можно приступить к реакции терминирующего секвенирования: введения флуоресцентной метки в фрагменты ДНК разной длины, которые будут далее анализироваться на одной из платформ. Фрагменты разной длины образуются благодаря обрыву цепи по время ПЦР, который происходит во время встраивания флуоресцентно меченых дидезоксинуклеотидов. Проведение данного этапа, для дальнейшего исследования на всех платформах (ABI 310, 31xx, 3500 и 3730 ) успешно обеспечивается наборами для проведения терминирующей реакции BrightDye. Набор реактивов состоит из готовой смеси для секвенирования BrightDye и буфера для секвенирования.

В готовую смесь для проведения терминирующего секвенирования достаточно добавить образец ДНК для секвенирования и праймеры согласно протоколу (прикреплен к данному обзору). Набор реактивов полностью аналогичен реактивам Bigdye 3.1, и позволяет получить аналогичные результаты, что подтверждено ведущими лабораториями Москвы и Новосибирска.

На рисунках 1 и 2 представлены результаты проведения секвенирования с использованием BrigthDye и Bigdye в сравнении. Результаты любезно предоставлены исследователями из Института цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск.

РИС1.png

Рис.1. Сравнение секвенирования с использованием BrightDye (A), Bigdye (Б), в 35 мкл реакционной смеси добавляли 4 мкл готовой смеси для секвенирования, количество образца ДНК (pGEM ) - 300 fmole, количество праймера - 8 pmole.

РИС2.png

Рис.2. Сравнение секвенирования с использованием BrightDye (A), Bigdye (Б), в 35 мкл реакционной смеси добавляли 2 мкл готовой смеси для секвенирования, количество образца ДНК (pGEM ) - 300 fmole, количество праймера - 8 pmole.

Из рисунков видно, что реактивы дают аналогичные результаты, причем при разбавлении аликвоты готовой смеси для секвенирования в 2 раза, качество полученных результатов не страдает.

Многократное разбавление готовых смесей для секвенирования

Ни для кого из нас не секрет, что даже при разбавлении готовой смеси для секвенирования многократно по сравнению с рекомендуемым протоколом, возможно проведение удачной реакции секвенирования. Мы предлагаем дополнительно приобрести буфер для секвенирования, для этих целей: буфер для секвенирования BrightDye/Bigdye (может использоваться для постановки реакции как с BrightDye так и с Bigdye), буфер для секвенирования BrightDye (специально разработан для использования совместно с BrighDye).

Специальные добавки для улучшения качества реакции секвенирования

Специально для сложных образцов ДНК мы предлагаем воспользоваться нашей новинкой - добавкой к BigDye 3.1 для оптимизации секвенирования сложных образцов.

Также, мы рекомендуем другую нашу новинку:буфер для оптимизации работы BigDye 3.1 X64: он имеет ионную силу, аналогичную ионной силе BigDye 3.1 и 1.1. Данная добавка (с разбавлением в 64 раза) увеличивает активность полимеризации и скорость полимеризации в 4 раза. Улучшает соотношение высоты пиков в результатах секвенирования.

Очистка реакционной смеси после реакции с терминирующими дидезоксинуклеотидами

После проведения реакции с терминирующими дидезоксинуклеотидами, очень важно правильно провести очистку, перед проведением анализа образца на платформе ABI. Из нашего опыта общения с клиентами хочется акцентировать внимание на этом этапе - грамотная очистка образца поможет избежать многих проблем и обеспечит вас хорошими результатами. Мы предлагаем 2 варианта очистки, каждый из которых протестирован для очистки перед секвенированием по Сэнгеру.

Набор для очистки реакционной смеси D-Pure Dye специально был разработан для данного этапа проведения секвенирования. При очистке используются магнитные частицы, и позволит очистить образец ДНК без этапа центрифугирования и фильтрации. Каждый компонент был оптимизирован для удаления солей и не использованных в реакции полимеризации дидезоксинуклеотидов.

В качестве альтернативы мы хотим предложить набор для энзиматической очистки ПЦР-смеси, который также специально предназначен для очистки перед проведением секвенирования - это набор ферментов для быстрой очистки реакционной ПЦР реакции от New England Biolabs. Входящие в состав смеси ферменты - экзонуклеаза I и щелочная фосфатаза обеспечивают недорогую очистку ПЦР-смеси за 15 минут. Набор специально предназначен для исследователей, которые хотят отойти от традиционной очистки при помощи колонок, экстракции и осаждения.

Если вы привыкли использовать для очистки AMPure XP, Agencourt Beckman, и не хотите менять методику очистки - мы можем предложить уменьшить стоимость очистки, не меняя протокола при помощи набора для очистки ПЦР-реакции AmpliClean

Полимеры для секвенирования на различных платформах и буферные растворы для электрофореза

Для проведения непосредственно капиллярного электрофеза вам потребуется заполнить капилляры вашего приборы полимером определенного типа. Между собой полимеры отличаются процентным содержанием диметилакриламида. Например, мы предлагаемполимерные денатурирующие разделительные матрицы (полимеры) для всех актуальных платформ: NanoPOP 4 для 3130, NanoPOP 4 для 310/3100, NanoPOP 6 для 3130, NanoPOP 6 для 310/3100, NanoPOP 7 для 3130, NanoPOP 7 для 3500, NanoPOP 7 для 3730.

Буферные растворы представлены буферами с ЭДТА CE10X, с ЭДТА NanoPOP 10X, NanoPOP 1X, ЭДТА CE10X для 3500.

Все полимеры являются полными аналогами полимеров серии POP, и были протестированы ведущими научными центрами Москвы и Новосибирска (данные не представлены). Отдельно отмечалось, что полимеры серии NANOPOP позволяют разделять пики в составе гомополимеров после 900 п.о. Пользователи имеют возможность начать использовать новый полимер для своего анализатора, не меняя существующий рабочий модуль и с использованием стандартного протокола и методики. Нет необходимости в новой спектральной калибровке приборов.

Вы можете использовать новую матрицу для улучшения пропускной способности и разрешения Вашего 3100 Genetic Analyzer, не затрачивая средств на изменение других параметров анализатора.

Весь перечень доступных полимеров и буферных растворов для электрофореза с ценами можно посмотреть здесь.

Очистка капилляров

Мы рады также представить средство для очистки капилляров Care, который помогут вас увеличить срок службы капилляров и улучшить качество получаемых результатов. Раствор для регенерации внутренней поверхности капилляров был успешно использован с ABI 310, 3100, 3130Xl и 3730XL.

Кроме перечисленных выше реактивов, доступны также стандарты длин ДНК (красный, оранжевый, двойной) и раствор формамида (для 3730, 3130, 3100, 310).

Мы искренне надеемся, что информация, которую мы сегодня представили вашему вниманию будет полезна и позволит удешевить, убыстрить и упростить проведение ежедневной работы в лаборатории.

Хочется пожелать вам и вашим близким весело встретить наступающий год, хорошо отдохнуть во время новогодних и рождественских праздников и с новыми силами приступить к реализации самых смелых и амбициозных планов в новом 2015 году!

к списку обзоров