Реактивы и оборудование
для лабораторий

#53 Публикации по теме секвенирование больших геномов при помощи технологии Oxford Nanopore Technologies

Сегодня мы начнем с вами небольшую серию обзоров, посвященную статьям с использованием технологии нанопорового секвенирования.  Получается, что наиболее наглядным способом при советах по реализации протоколов является демонстрация конкретных статей с похожими задачами.

Начнем наш рассказ сегодня мы с примеров использования технологии для сборки больших геномов.

Говоря о сборке больших геномов, мы говорим прежде всего об организмах, геном которых превышает 100 Mb в размере. Сюда входит большое разнообразие организмов.

ONT 1.png

Рисунок 1

Возможность получать длинные риды, вместе с возможностью получать больше данных секвенирования открывает большие возможности для изучения больших геномов при помощи технологии нанопорового секвенирования.

Повторяющиеся регионы и большие участки структурных вариаций – одна из проблем при изучении больших геномов. Традиционное секвенирование с использованием коротких ридов как правило генерирует риды длиной 150-300 bp. В то же время, нанопоровая технология позволяет секвенировать ДНК с той длиной, которой она обладает. Фрагменты длиной несколько тысяч пар оснований анализируются в ежедневной практике, а также появляется все больше примеров ультра длинных прочтений порядка 1 Mb. Разумеется, такие длинные риды с большой вероятностью захватывают повторяющиеся регионы ДНК,а также регионы с структурными вариациями. В результате, нанопоровое секвенирование дает более полное представление о генетических вариациях и SNV. Такая информация позволяет глубже понять функцию генома. Исследователи могут также использовать информация о гаплотипах для того чтобы пролить свет на разнообразие совокупности генов, что особенно важно при изучении исчезающих видов.

Согласно профессору Michael  из института J. Craig Venter: Качество ДНК и длина ридов являются наиболее важными факторами при секвенировании больших геномов.

В то же время он утверждает, что длина ридов 5-10 kb, которая может быть достигнута альтернативными методиками (не нанопоровыми) – это хорошее достижение, однако настоящим прорывом при сборке больших геномов может стать получение ридов длиннее чем 20 kb. Такие риды могут дать информацию о главных типах повторяющихся транспозонов и тандемных дупликаций. В лаборатории профессора Michael получают риды длиной до 1 Mb, однако он считает, что с увеличением длины ридов мы вскоре сможем перейти от сборки геномов к прямому секвенированию генома.

Профессор Jansen из Future Genomics считает, что в современном состоянии прогресса технологии в течение 5 лет возможно перейти к прямому секвенированию генома. Нанопоровое секвенирование позволяет генерировать ультра длинные риды, так как поры получают информацию от фрагментов ДНК с любой длиной.

Это позволяет исследователям исследовать экстремально длинные участки с повторами или структурными вариациями.

На сегодняшний день (июнь 2018 года) наиболее длинный рид, полученный при помощи технологии составляет 2,3 Mb.

На момент публикации абстракта, на который мы ссылаемся, самый длинный рид был получен в Университете Бирмингема и составлял 882 kb14. Сотрудники университета отмечали: самым важным фактором, определяющим длину рида, является качество образца. Это более важно чем пробоподготвка, которая сравнительно проста, особенно с использованием протокола Rapid Sequencing.

Kit Oxford Nanopore Technologies, и это более важно чем само секвенирование, которое в принципе представляет собой просто нанесение образца на ячейку.

Давайте рассмотрим с вами конкретный случай секвенирования генома растений. Сборка геномов растений особенно сложна из-за некоторого количества усложняющих факторов, которые включают в себя большой геном (например, 22 Gb Loblolly pin или 20 Gb Norway spruce), и большое количество повторов генома, из-за полиплоидной природы многих видов растений. Некоторые геномы растений входят в большие генетические семьи, которые могут содержать в себе до 700 членов с большой степенью гомологии. 

Согласно  профессору Usadel из университета Ахена, эти факторы делают сложным получение точной информации о геноме растений особенно сложным, по сравнению со сборкой геномов млекопитающих.

 Информация по его сообщению представлена на рис.2

ONT 5.png

Рисунок 2

Другим примером сборки больших геномов может являться сбора генома Arabidopsis thaliana.

Этот вид, благодаря относительно небольшому геному (~150 Mb), быстрому росту, является популярной моделью для изучения и в 2000 году было первым растением, чей геном был секвенирован. Однако результаты, полученные при помощи секвенирования с короткими ридами были дополнены в Институте C. Ventor, всего за 4 дня с использованием всего одной ячейки от Oxford Nanopore. Полученные данные были более полными чем существовавший золотой стандарт TAIR1035 assembly.

ONT 2.png

Рисунок 3

Перечень 24 референсных статей, с использованием которых мы представили данный абстракт об использовании технологии нанопорового секвенирования представлены в доступном для скачивания в документе ниже.

к списку обзоров