Реактивы и оборудование
для лабораторий

#48 Эндонуклеазы рестрикции производства New England Biolabs

Эндонуклеазы рестрикции производства New England Biolabs

NEB завоевал репутацию ведущего производителя ферментов в мире и поставщика ферментов рестрикции номер один для научного сообщества. Продолжая работать над востребованностью своей продукции, NEB стремится к усовершенствованию своих ферментов, повышая их чистоту и качество.

Научные сотрудники New England Biolabs продолжают развивать портфолио компании, одновременно работая над его расширением и поиска новых отраслей применения продукции NEB. Как следствие, учёные NEB регулярно публикуют свои научные работы и выигрывают гранты. NEB обладают крупнейшим исследовательским департаментом в направлении ферментов рестрикции, благодаря чему компания впервые коммерциализировала рекомбинантные ферменты, впервые на рынке представила никирующие ферменты и разработала готовую смесь для ферментов рестрикции.

Ферменты рестрикции были открыты более 40 лет назад при проведении исследований феномена сайт-специфичной рестрикции и модификации бактериофагов. Ферменты рестрикции защищают бактерию от вирусного вторжения. Общепринятая точка зрения заключается в том, что это их природная роль. Они работают как иммунная система бактерий. Когда штамм E.coli, лишённый ферментов рестрикции, подвергается атаке вирусом, вирусные частицы могут успешно инфицировать клетку. Когда какой-либо штамм содержит рестриктазы, вероятность успешного заражения вирусом резко снижается. Присутствие различных рестриктаз в клетке оказывает множественное действие: клетка с четырьмя или пятью типами рестриктаз считается условно неубиваемой.

Среди первых очищенных рестриктаз были EcoRI и EcoRII, выделенные из E.coli, и HindII и HindII, выделенные из Haemophilus influenzae. Эти ферменты разрезали ДНК в специфичных сайтах, создавая отдельные фрагменты, которые могут быть объединены в лабораторных условиях. Исследователи вскоре осознали, что рестриктазы представляют собой новый уникальный инструмент изучения организации, экспрессии и функционирования генов.

По мере распространения рестриктаз в молекулярно-биологической среде в конце 1970-х, компании наподобие New England Biolabs приступили к более детальным исследованиям. Помимо некоторых вирусов, рестриктазы были обнаружены у прокариот. Многие тысячи бактерий и архей в настоящее время изучаются на предмет наличия ферментов рестрикции. Анализ сиквенсов прокариотических геномов показал, что все они схожи друг с другом – все геномы свободноживущих бактерий и архей кодируют рестриктазы.

Ферменты рестрикции чрезвычайно разнообразны, они варьируются по размеру начиная от Pvull (157 аминокислотных остатков) до гигантской Cjel (1250 аминокислотных остатков) и более. Помимо 4000 изученных активностей, которые были охарактеризованы, было обнаружено также 330 специфичных сайтов. Более 30% из них были идентифицированы специалистами NewEngland Biolabs. Поиск новых сайтов специфичности продолжается в рамках биохимических исследований, через анализ клеточных экстрактов, а также в рамках информационных исследований, путём компьютерного анализа сиквенсов геномов. Несмотря на то, что большинство известных сегодня сайтов рестрикции ферментов являются дубликатами – изошизомерами, регулярно обнаруживаются и не известные ранее сайты рестрикции.

Pic1.jpg

Р-М системы

Рестриктазы как правило действуют в комплексе с одним или двумя модифицирующими ферментами (ДНК-метилтрансферазами), защищающими хозяйскую ДНК клетки от разрезания. Модифицирующие ферменты обладают специфичностью к тем же сайтам, что и рестриктазы,в комплексе с которыми они действуют. Вместо разрезания они метилируют одно из оснований на каждой из цепочек ДНК. Метильные группы присоединяются к ведущей цепи ДНК в сайте связывания и препятствуют воздействию рестриктазы. Вместе с модифицирующим ферментом рестриктазы формируют систему рестрикции-модификации (Р-М систему). В некоторых Р-М системах рестриктаза и метилтрансфераза разделены между собой и действуют независимо друг от друга. В прочих же системах они представлены как разные субъединицы одного большого комплекса.

Типы рестриктаз

В классической классификации рестриктазы делятся на 4 типа в зависимости от состава базовой субъединицы, сайта рестрикции, сайт-специфичности и требований к кофактору. Однако изучение аминокислотного состава рестриктаз показало, что на молекулярном уровне существует гораздо больше различных типов ферментов.

К I типу рестриктаз относят сложные, состоящие из нескольких субъединиц, Р-М системы, которые разрезают ДНК на случайном расстоянии от своего сайта рестрикции. Ферменты I типа представляют биохимический интерес, однако на редко используются на практике, поскольку они не производят отдельных рестрикционных фрагментов или различимых на геле паттернов.

Ферменты II типа разрезают ДНК в пределах или на небольшом удалении от своих сайтов рестрикции. Они создают отдельные рестрикционные фрагменты и различимые на геле паттерны. Это единственный тип ферментов, который используется в лабораторных условиях при изучении ДНК и клонировании генов. II тип ферментов не выделяется в отдельный класс похожих белков, он объединяет в себе белки самых разных видов. Рестриктазы II типа зачастую сильно отличаются по аминокислотному составу друг от друга, а также от всех остальных известных белков. Они представляют класс белков, которые нередко играют важную роль во взаимодействии паразит-хозяин.

Ферменты III типа также представляют собой большие белковые комплексы. Они разрезают ДНК вне своих сайтов рестрикции и им необходимы два таких сайта в противоположных направлениях в пределах одной молекулы ДНК, чтобы завершить разрезание.

Ферменты IV типа узнают модифицированную, как правило – метилированную ДНК, и представляют собой McrBC и Mrr системы E.coli.

IMG_20170911_101852.jpg

 Компания SkyGen является авторизованным дистрибьютором New England Biolabs и поставляет все рестриктазы производства New England Biolabs. Ознакомиться со списками рестриктаз Вы можете на нашей сайте: стандартные рестиктазы и  High Fidelity™ (HF) ферменты рестрикции.

 Подобрать необходимую рестриктазу для решения Ваших исследовательских задач Вы можете на сайте NEB в разделе Enzyme Finder:https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/enzyme-finder

Картинка-загадка от СкайДжин!

РЮКЗАК.jpg

к списку обзоров